●前言
1小黑楊遺傳轉化體繫的建立 1
1.1 抗生素對小黑楊葉片離體培養的影響 1
1.1.1 不同濃度卡那霉素對小黑楊生長的影響 1
1.1.2 不同濃度G418 對小黑楊生長的影響 3
1.2 抑菌劑的抑菌效果及對小黑楊生長的影響 4
1.2.1 頭孢類抗生素對農杆菌的抑制作用 4
1.2.2 AgNO3 對農杆菌的抑制作用 6
1.2.3 抑菌劑對小黑楊葉片分化的影響 6
1.2.4 AgNO3 對小黑楊葉片分化的影響 8
1.3 農杆菌介導的小黑楊轉基因體繫的建立 9
1.3.1 不同處理對小黑楊遺傳轉化的影響 9
1.3.2小黑楊卡那霉素抗性芽的篩選 13
1.3.3 轉化株繫的擴繁與生根 13
1.4 確定小黑楊遺傳轉化體繫 14
2 轉betA 基因小黑楊研究 17
2.1 轉betA小黑楊的獲得 17
2.1.1 轉betA小黑楊抗性不定芽的獲得 17
2.1.2 轉betA小黑楊PCR 檢測 18
2.1.3 轉betA小黑楊Southern 雜交 18
2.2 轉betA小黑楊耐鹽性分析 19
2.2.1 NaCl 脅迫下轉betA小黑楊甜菜堿含量的比較 20
2.2.2 非脅迫下轉betA小黑楊甜菜堿含量的時序變化 20
2.2.3 NaCl 脅迫下轉betA小黑楊甜菜堿含量的時序變化 21
2.2.4 轉betA小黑楊在輕度鹽堿地的生長表現 22
3 轉codA 基因小黑楊研究 25
3.1 轉codA小黑楊的獲得 25
3.1.1 將codA 整合到小黑楊基因組 25
3.1.2 codA 基因在mRNA 水平的表達 27
3.2 轉codA小黑楊耐鹽堿性分析 28
3.2.1 NaCl 脅迫下轉codA小黑楊的生長表現 28
3.2.2 NaHCO3 脅迫下轉codA小黑楊的生長表現 31
4 轉抗蟲基因小黑楊研究 34
4.1 轉抗蟲基因小黑楊的獲得 34
4.1.1小黑楊抗蟲基因的遺傳轉化 34
4.1.2 轉抗蟲基因小黑楊PCR 檢測 35
4.1.3 轉抗蟲基因小黑楊Southern 雜交 35
4.2 轉基因小黑楊對舞毒蛾幼蟲的毒殺能力 36
5 轉TaLEA 基因小黑楊研究 38
5.1 轉TaLEA小黑楊的獲得 38
5.1.1 將TaLEA 整合到小黑楊基因組中 38
5.1.2 TaLEA 基因在mRNA 水平的表達 39
5.2 轉TaLEA小黑楊的耐鹽性提高 40
5.2.1 NaCl 脅迫下轉TaLEA小黑楊相對電導率比較 40
5.2.2 NaCl 脅迫下轉TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 41
5.2.3 NaCl 脅迫下轉TaLEA小黑楊淨光合速率比較 41
5.2.4 NaCl 脅迫下轉TaLEA小黑楊葉綠素含量比較 42
5.2.5 轉TaLEA小黑楊耐鹽株繫的選擇 42
5.3 轉TaLEA小黑楊的抗旱性提高 43
5.3.1 干旱脅迫下轉TaLEA小黑楊相對電導率比較 43
5.3.2 干旱脅迫下轉TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 43
5.3.3 干旱脅迫下轉TaLEA小黑楊淨光合速率比較 43
5.3.4 干旱脅迫下轉TaLEA小黑楊葉綠素含量比較 44
5.3.5 轉TaLEA小黑楊抗旱株繫的選擇 45
5.4 轉TaLEA小黑楊的耐寒性提高 45
5.4.1 低溫脅迫下轉TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 45
5.4.2 低溫脅迫下轉TaLEA小黑楊相對高生長比較 45
5.4.3 低溫脅迫下轉TaLEA小黑楊冷害指數比較 46
5.4.4 轉TaLEA小黑楊耐寒株繫的選擇 46
6 轉TaLEA 基因小黑楊表達特性研究 49
6.1 轉TaLEA小黑楊基因表達譜分析 49
6.1.1 差異基因的功能分類 49
6.1.2 差異基因的基因本體和代謝途徑分析 49
6.1.3 差異基因的qRT-PCR 驗證 52
6.2 轉TaLEA小黑楊蛋白表達譜分析 55
6.2.1 差異蛋白的功能分類 55
6.2.2 差異蛋白與差異基因的比較 56
7 轉TaLEA 基因小黑楊生長穩定性研究 62
7.1 轉TaLEA小黑楊苗期生長性狀Logistic 模型構建 62
7.1.1 轉TaLEA小黑楊苗高和地徑方差分析 62
7.1.2 轉TaLEA小黑楊苗高年生長模型構建 63
7.1.3 轉TaLEA小黑楊地徑年生長模型構建 65
7.1.4 轉TaLEA小黑楊苗高年生長階段劃分 67
7.1.5 轉TaLEA小黑楊地徑年生長階段劃分 68
7.1.6 轉TaLEA小黑楊苗高、地徑與速生期各參數關繫 68
7.1.7 轉TaLEA小黑楊株繫苗高生長過程比較 69
7.2 不同地點轉TaLEA小黑楊遺傳穩定性分析 71
7.2.1 不同地點轉TaLEA小黑楊樹高和胸徑的變異 71
7.2.2 不同地點不同轉TaLEA小黑楊株繫AMMI 方差分析 73
7.2.3 不同地點不同轉TaLEA小黑楊株繫的基因型-環境交互作用 73
7.3 轉TaLEA小黑楊多性狀比較 74
7.3.1 轉TaLEA小黑楊株繫間各性狀比較 74
7.3.2 轉TaLEA小黑楊株繫間各性狀平均值及變異參數分析 77
7.3.3 轉TaLEA小黑楊株繫各性狀相關分析 77
7.3.4 轉TaLEA小黑楊株繫綜合評價 79
8 轉PsnWRKY70 基因小黑楊研究 81
8.1 生物及非生物脅迫條件下PsnWRKY 時序表達特性 81
8.1.1 PsnWRKY 基因及蛋白質特征 82
8.1.2 PsnWRKY 蛋白多序列比對及進化分析 83
8.1.3 不同脅迫條件下PsnWRKY 表達的時序變化 86
8.2 PsnWRKY70 啟動子功能研究 89
8.2.1 PsnWRKY70 啟動子的克隆及轉錄起始位點的確定 89
8.2.2小黑楊cDNA 文庫的構建及質量檢測 92
8.2.3 酵母單雜交篩選PsnWRKY70 的上遊調控因子 93
8.2.4 酵母單雜交篩選結果的驗證 98
8.3 酵母雙雜交篩選PsnWRKY70 的互作蛋白 100
8.3.1 誘餌載體的構建 100
8.3.2 誘餌載體的自激活檢測 101
8.3.3 WRKY 蛋白在酵母細胞中的表達 103
8.3.4 pGBKT7-WRKY 與pGADT7-cDNA 共轉化後的篩選 103
8.3.5 陽性克隆的驗證 104
8.3.6 陽性克隆所攜cDNA 片段的生物信息學分析 105
8.3.7 互作蛋白的GST-pull down 體外驗證 106
8.4 PsnWRKY70 基因功能研究 111
8.4.1 PsnWRKY70 在小黑楊不同組織部位的表達特性 112
8.4.2 PsnWRKY70 植物表達載體的構建 112
8.4.3 轉PsnWRKY70小黑楊的獲得 115
8.4.4 轉PsnWRKY70小黑楊耐鹽性分析 119
8.4.5 轉PsnWRKY70小黑楊耐旱性分析 123
8.4.6 轉PsnWRKY70小黑楊抗病性分析 125
8.4.7 NaCl 脅迫下轉PsnWRKY70小黑楊轉錄組分析 128
參考文獻 138