《基因操作技術》按照企業真實崗位設置來編寫項目，即計算機模擬構建重組載體→總DNA、質粒、mRNA和cDNA的提取、檢測和制備→體外擴增目的基因→構建含有外源基因的重組載體→重組載體轉化大腸杆菌→目的基因在大腸杆菌中的表達及純化等，*後以新型冠狀病毒核衣殼蛋白的表達為例，設計了一個模擬的客戶訂單，編排成一個綜合性大實驗。每一個項目既相對獨立又彼此緊密相連，通過這些項目的實施，學生可以熟練掌握*基本的基因操作技術，並建立一個比較全面繫統的工作程序框架。依照職業教育行動導向教學需要，將每個項目分成“學習目標”“項目簡介”“項目引導”“項目實施”“復盤提升”和“項目拓展”六個部分，其中“項目實施”中的“擬定計劃”“材料準備”“任務記錄”“項目交付”以及“復盤提升”以《項目學習工作手冊》的形式呈現，注重思政與職業素養教育。此外，本書配有豐富的數字化資源，可掃描二維碼觀看學習；電子課件可從www.cipedu.com.cn下載參考。

本教材不僅適用於高職高專生物技術等相關專業學習，也可作為基因操作相關人員及醫學生物技術PCR檢測工（1 X證書）、核酸檢測員的主要參考書籍。

緒論

【學習目標】1

一、基因操作技術的基本概念1

二、基因操作技術的過程和內容2

三、基因工程的誕生與發展3

四、基因工程的應用6



項目一計算機模擬構建重組載體

【學習目標】10

【項目簡介】10

【項目引導】10

一、核酸數據庫11

二、 UniProt蛋白質數據庫11

【項目實施】14

任務一數據庫中查找SARS-CoV-2 N基因序列14

任務二SnapGene模擬構建pET28a（ ）-N重組載體15

【復盤提升】20

【項目拓展】20

一、生物信息學20

二、序列比對與BLAST21



項目二總DNA的提取和檢測

【學習目標】23

【項目簡介】23

一、CTAB法提取植物細胞染色體DNA23

二、SDS法抽提總DNA24

【項目引導】24

一、核酸的分子組成24

二、DNA的結構24

三、核酸濃度的測定方法26

四、凝膠電泳技術28

五、核酸的保存31

【項目實施】32

任務一SDS法提取細菌總DNA32

任務二紫外分光光度計測定總DNA濃度33

任務三瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA33

【復盤提升】34

【拓展知識】34

一、樣品的采集和保存34

二、酚氯仿法提取全血DNA35

三、CTAB法提取植物DNA37



項目三質粒的提取及檢測

【學習目標】38

【項目簡介】38

【項目引導】40

一、載體40

二、質粒載體40

三、質粒載體的種類41

四、標記基因44

【項目實施】47

任務一堿裂解法提取大腸杆菌質粒47

任務二紫外分光光度計測定質粒濃度47

任務三瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒47

【復盤提升】48

【項目拓展】48

一、乳糖操縱子48

二、常用大腸杆菌表達載體49



項目四mRNA提取和cDNA制備

【學習目標】56

【項目簡介】56

【項目引導】57

一、RNA概述57

二、RNA的種類和功能57

三、RNA的結構與功能58

四、RNA的生物合成與加工61

五、RNA提取方法61

【項目實施】62

任務一Trizol法提取動植物總RNA63

任務二變性瓊脂糖凝膠檢測總RNA63

任務三mRNA提取64

任務四cDNA合成技術65

【復盤提升】66

【項目拓展】66

一、植物病毒RNA提取66

二、cDNA的制備66



項目五體外擴增目的基因

【學習目標】71

【項目簡介】71

【項目引導】71

一、DNA的生物合成71

二、PCR的原理73

三、DNA聚合酶75

四、PCR引物設計76

五、PCR反應體繫77

【項目實施】78

任務一引物設計78

任務二模板DNA提取81

任務三PCR擴增目的片段81

任務四瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物82

任務五回收PCR產物82

【復盤提升】83

【項目拓展】83

一、RT-PCR83

二、PCR技術的應用84

三、DNA人工合成技術85



項目六構建含有外源基因的重組載體

【學習目標】87

【項目簡介】87

【項目引導】88

一、工具酶88

二、提高重組率的方法94

【項目實施】94

任務一DNA片段和質粒的雙酶切94

任務二酶切產物的膠回收96

任務三DNA片段和載體DNA的連接96

【復盤提升】97

【項目拓展】97

一、cDNA末端快速擴增技術97

二、一步法克隆100



項目七重組載體轉化大腸杆菌

【學習目標】103

【項目簡介】103

【項目引導】104

一、感受態細胞104

二、轉化方法104

三、重組子的篩選策略105

【項目實施】106

任務一E.coli感受態細胞的制備107

任務二熱激法轉化E.coli107

任務三轉化子的篩選——菌落PCR107

任務四轉化子的鋻定——酶切驗證108

任務五轉化子的鋻定——測序及比對108

【復盤提升】110

【項目拓展】110

一、常用表達宿主110

二、動植物細胞的轉化113

三、DNA測序115

四、CRISPR-Cas9116



項目八目的基因在大腸杆菌中的表達及純化

【學習目標】119

【項目簡介】119

【項目引導】120

一、翻譯120

二、Ni-親和色譜法純化融合蛋白121

三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳122

【項目實施】124

任務一目的基因在大腸杆菌中的誘導表達124

任務二可溶性重組蛋白質的提取125

任務三SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鋻定目的蛋白126

任務四重組蛋白質緩衝液的置換及保藏128

任務五重組蛋白質濃度測定128

【復盤提升】129

【項目拓展】129

一、包涵體的提取129

二、影響外源基因的高效表達的因素132

三、蛋白質印跡法133

四、蛋白質序列測定135



項目九綜合性生產實訓——以新型冠狀病毒核衣殼蛋白的表達為例

【學習目標】137

【項目簡介】137

【項目引導】138

一、接單評估138

二、方案設計138

三、項目執行138

四、產品交付139

【項目實施】139

【產品交付】144

一、產品綜合報告144

二、交貨單144



附錄

一、常用儀器設備及使用146

二、基因操作技術常用溶液的配制152

三、常用核酸蛋白質換算數據156



參考文獻

2020年2月13日，國務院印發了《國家職業教育改革實施方案》，對職業教育提出了全方位的改革設想，提出了“三教”（教師、教材、教法）改革的任務。教材是教學內容的支撐和依據，也是人纔培養的重要載體。

基因操作技術是現代生物技術的基礎技術之一，也是生物技術類專業核心課程之一。本教材按照基因操作的流程，設計了八個相對獨立的項目；後以新型冠狀病毒的核衣殼蛋白（N蛋白）為實例，編排成一個綜合性實訓項目，在這個綜合性實訓項目中，每一步既相對獨立又與下一步緊密相連，達到全面綜合提升基因操作的技能目的。每個項目分成“學習目標”“項目簡介”“項目引導”“項目實施”“復盤提升”和“項目拓展”六個部分。“學習目標”明確知識目標、技能目標和思政目標；“項目簡介”介紹項目的背景知識，目的是激發學生的學習興趣；“項目引導”介紹項目實施中必要的專業知識和技能；“項目實施”中融入了視頻及信息化資源，使枯燥的技術變得形像生動，可掃描二維碼學習觀看，“項目實施”中的“擬定計劃”“材料準備”“任務記錄”“項目交付”以及“復盤提升”是以《項目學習工作手冊》形式呈現，“復盤提升”環節中讓學生復盤自己的技能操作，著力培養學生分析解決問題的能力，“項目拓展”擴充項目的知識維度，介紹一些前沿的知識技能。本書配有電子課件，可從www.cipedu.com.cn下載參考。

本教材是在2020年武漢經歷新型冠狀病毒疫情期間完成的。編者為來自教學一線和產業一線的教師和工程師，既有扎實的理論功底，也有豐富的實踐經驗。本教材得到編者所在單位的大力支持，除此之外，程文［普健生物（武漢）科技有限公司］、費小戰［福因德科技（武漢）有限公司］、李軍（武漢愛博泰克生物科技有限公司）為本教材提供了大量的企業真實項目素材，在此一並表示感謝。

基因操作技術發展迅速，加之編者水平有限，時間比較倉促，書中難免存在疏漏和不足之處，殷切希望讀者指正（主編聯繫郵箱：27062103@qq.com），不勝感激。



編者

2020年10月