第1章  緒論 001

1.1細胞分析 001

1.1.1細胞的發現 001

1.1.2細胞培養與觀察 003

1.1.3細胞組分分析 005

1.1.4細胞研究的挑戰與機遇 007

1.2微流控芯片 007

1.2.1基本概念 007

1.2.2發展歷史 008

1.2.3微尺度下流體的基本特征 010

1.2.4微流控芯片應用領域 011

1.3微流控細胞分析 012

1.3.1發展過程 012

1.3.2微流控芯片的細胞培養 015

1.3.3單細胞分析 017

1.4微流控細胞分析發展趨勢 018

參考文獻 019

思考題 021



第2章  微流控芯片的設計與制作 022

2.1概述 022

2.2芯片材料 023

2.2.1無機材料 023

2.2.2硅彈性體材料 024

2.2.3熱固性與熱塑性材料 026

2.2.4凝膠材料 027

2.2.5紙基材料 028

2.2.6雜化材料 029

2.3芯片制作方法 030

2.3.1標準光刻法 030

2.3.2軟光刻法 034

2.3.3聚焦離子束加工法 035

2.3.4電子束光刻法 036

2.3.5三維打印技術 037

2.3.6芯片制作環境要求 039

2.4的集成 039

2.4.1微泵和微閥 039

2.4.2細胞 040

2.4.3芯片離心裝置 040

參考文獻 042

思考題 043



第3章  微流控細胞培養與微環境構建 045

3.1概述 045

3.2細胞培養 046

3.2.1二維培養 046

3.2.2三維培養 048

3.2.3靜態培養 049

3.2.4動態培養 053

3.2.5細胞共培養 057

3.3微環境構建 058

3.3.1物理因素作用 058

3.3.2化學因素作用 058

3.3.3細胞與細胞間相互作用 059

3.3.4細胞與細胞外基質間相互作用 061

3.4總結與展望 062

參考文獻 063

思考題 068



第4章  微流控細胞操控技術 069

4.1概述 069

4.2細胞分選 070

4.2.1磁方法 070

4.2.2電方法 071

4.2.3光方法 074

4.2.4聲方法 075

4.2.5流體動力學方法 077

4.2.6大小和可變形性 079

4.3細胞捕獲 080

4.3.1抗體親和識別 080

4.3.2核酸適配體識別 081

4.3.3微結構捕獲 081

4.4細胞處理 082

4.4.1細胞裂解 082

4.4.2細胞配對和融合 085

4.4.3細胞膜穿孔 086

4.5總結與展望 088

參考文獻 088

思考題 090



第5章  微流控單細胞分析 091

5.1概述 091

5.1.1單細胞分析與微流控 091

5.1.2單細胞分析技術發展歷程 093

5.2單細胞分離 096

5.2.1微閥門技術 096

5.2.2微孔和微壩 096

5.2.3流體動力分離 097

5.2.4介電泳 098

5.2.5液滴法 098

5.3單細胞裂解 099

5.3.1化學法 099

5.3.2機械法 100

5.3.3電裂解法 100

5.3.4激光法 101

5.3.5熱裂解法 102

5.4單細胞檢測分析 102

5.4.1光學分析 102

5.4.2電化學分析 104

5.4.3質譜分析 105

5.5總結與展望 107

參考文獻 107

思考題 114



第6章  開放式微流控細胞分析 116

6.1概述 116

6.2開放式微流控的基本概念 116

6.3活體單細胞提取器 117

6.3.1基本原理 117

6.3.2計算流體力學模擬 118

6.3.3單細胞提取異質性分析 118

6.3.4單細胞水平上細胞黏附強度與細胞活性關聯性分析 120

6.4單個循環腫瘤細胞在內皮細胞層上的黏附分析 121

6.4.1細胞-細胞黏附分析測量原理 121

6.4.2計算流體力學模擬 122

6.4.3循環腫瘤細胞在內皮細胞層上的黏附分析 123

6.4.4藥物對細胞-細胞黏附的影響 124

6.5微流體細胞切割刀技術 126

6.5.1基本原理 126

6.5.2計算流體力學模擬 127

6.5.3細胞切割與損傷修復 128

6.5.4細胞器傳輸速度測定 128

6.6總結與展望 130

參考文獻 130

思考題 130



第7章  微流控細胞遷移研究 132

7.1概述 132

7.2細胞遷移研究的傳統方法 133

7.2.1細胞劃痕法 133

7.2.2培養插入法 134

7.2.3電阻抗傳感法 135

7.2.4Boyden小室法/Transwell法 136

7.3微流控芯片在細胞遷移中的應用 137

7.3.1趨化性 137

7.3.2趨電性 140

7.3.3趨觸性 142

7.4總結與展望 143

參考文獻 143

思考題 145



第8章  微流控液滴制備方法與應用 146

8.1概述 146

8.1.1液滴的基本概念 147

8.1.2液滴的功能與主要特征 147

8.1.3液滴生成原理 148

8.2微流控液滴制備方法 149

8.2.1T形交叉結構法 149

8.2.2聚焦流結構法 149

8.2.3同流結構法 150

8.2.4其他方法 150

8.3液滴微流體的生物醫學應用 154

8.3.1細胞載體 154

8.3.2細胞包封 154

8.3.3細胞培養 156

8.3.4細胞冷凍、復蘇、釋放 157

8.4單細胞研究 158

8.4.1單細胞包封與培養 159

8.4.2單細胞分選 159

8.4.3單細胞分析檢測 160

8.5組織工程 161

8.5.1類器官 161

8.5.2可注射療法 162

8.5.3干細胞治療 163

8.6總結與展望 164

參考文獻 165

思考題 167



第9章  液滴單細胞分析 169

9.1概述 169

9.1.1單細胞基因組和轉錄組分析 170

9.1.2單細胞蛋白質分析 170

9.1.3單細胞代謝分析 170

9.2液滴的形成 171

9.2.1噴墨打印技術 171

9.2.2芯片上的液滴制備技術 174

9.3單細胞封裝 176

9.3.1被動封裝法 177

9.3.2主動封裝法 178

9.4液滴單細胞質譜分析 178

9.4.1單細胞脂質分析 179

9.4.2單細胞代謝物分析 180

9.4.3單細胞蛋白質分析 181

9.5總結與展望 181

參考文獻 182

思考題 183



第10章  微流控芯片-質譜聯用細胞分析 184

10.1概述 184

10.2質譜儀 ESI 接口 185

10.2.1芯片直接噴口 186

10.2.2芯片外接接口 187

10.2.3一體化接口 187

10.3質譜儀 MALDI 接口 188

10.4芯片中細胞樣品的預處理 189

10.4.1微萃取芯片的制作 190

10.4.2MEC芯片的萃取效果 192

10.5微流控芯片-質譜聯用技術的應用 193

10.6總結與展望 194

參考文獻 195

思考題 197



第11章  微流控芯片上微生物的研究技術 199

11.1概述 199

11.2微生物的培養方式 200

11.2.1微生物的特點 200

11.2.2微生物培養基的選擇 200

11.2.3微生物接種方式 201

11.2.4微生物生長的影響因素 201

11.3基於微流控技術研究細菌的基本方法 202

11.3.1通道內培養 202

11.3.2微室內培養 203

11.3.3凝膠液滴包裹 204

11.3.4微流控培養的優勢 204

11.4微生物與微流控技術聯用的應用 205

11.4.1微生物培養與鋻定 205

11.4.2抗藥性檢測 206

11.4.3毒性檢測 206

11.4.4癌癥檢測與治療 207

11.4.5微生物燃料電池 207

11.4.6食品安全 208

11.5總結與展望 208

參考文獻 209

思考題 210



第12章  微流控芯片上組織/器官模擬 212

12.1概述 212

12.2器官芯片的特點 213

12.3器官芯片的構建方法 214

12.4器官芯片的類型 215

12.4.1肝 215

12.4.2腸 217

12.4.3肺 218

12.4.4血管 218

12.4.5腎 219

12.4.6腦 220

12.4.7多器官芯片 221

12.4.8全組織芯片 222

12.5器官芯片在藥代動力學研究中的應用 223

12.6總結與展望 224

參考文獻 225

思考題 226



第13章  微流控芯片-質譜聯用細胞分析儀的應用 227

13.1概述 227

13.2儀器性能與特點 228

13.2.1微流控通道細胞培養芯片 228

13.2.2微注射裝置 229

13.2.3細胞與顯微觀察 230

13.2.4細胞進樣與代謝物提取 230

13.2.5色譜預處理與 230

13.2.6質譜 233

13.2.7軟件 233

13.3儀器操作步驟 235

13.3.1芯片制作 235

13.3.2細胞培養 235

13.3.3培養基注入 235

13.3.4色譜分離 236

13.3.5質譜檢測 236

13.4儀器應用 236

13.4.1細胞缺氧分析 236

13.4.225-羥基維生素D3的生物轉化 237

13.4.3酸性微環境中7-羥基香豆素代謝 239

13.5儀器的應用前景 241

參考文獻 242

思考題 244

中國有句諺語，“工欲善其事，必先利其器”，為了解明細胞的生命過程，需要特殊的工具。作為生命組成——細胞，研究其相關的生物行為及其規律與本質，對於揭示生命的奧秘，探索疾病的機理與治療手段，提高人類的生存壽命與質量，都有著重要的意義。對細胞的研究是一個復雜的工程，細胞在人體內處於復雜的微環境之中，包括溫度、氧氣濃度、生物因子濃度、機械作用、細胞間相互作用、細胞基質間相互作用等，同時細胞體積微小、種類多樣，在細胞水平進行細胞識別、代謝物檢測、內部組分分析、細胞結構與功能表征、細胞間相互作用分析等工作也都有著很高的難度。

微流控（microfluidics）指的是使用微通道（尺寸為數十到數百微米）處理或操縱微小流體的繫統所涉及的科學和技術，是一門涉及化學、流體物理、微電子、新材料、生物學和生物醫學工程的新興交叉學科。因為具有微型化、集成化等特征，微流控裝置通常被稱為微流控芯片（microfluidic chip），又稱微全分析繫統（micro total analysis system，μTAS）或者芯片實驗室（lab on a chip，LOC），自20世紀90年代初發展以來，以其眾多的優勢而引起人們的關注。微流控芯片技術因其具有的一繫列優點，如樣品試劑消耗少、結構功能多樣化、集成化程度高、與細胞尺度接近等，近年來被廣泛地應用於細胞相關領域的研究，包括細胞培養、細胞捕獲、細胞分化、細胞遷移、細胞融合、藥物代謝、細胞通信、組織工程等內容，通過結合不同的分析檢測方法以及集成不同的功能，取得了巨大的研究進展，解決了很多傳統方法無法解決的問題。但是，如何在微流控芯片內更加高效簡便地對細胞進行操控定位，如何更好地模擬細胞在生命體內的生物微環境，從而進行體外生物繫統的構建用於生命醫療疾病的研究，仍然需要在相關技術、材料、方法等方面做出更深入的研究。

本書作者之一林金明教授自本世紀初開展微流控芯片的設計與研制，先後獲得多項項目的資助，繫統深入地開展了基於微流控技術的細胞分選與識別、細胞培養與觀察、細胞遷移、單細胞分析、細胞藥物代謝等多方面的研究。與島津公司合作研制開發了全球首款微流控芯片質譜聯用細胞分析裝置（Cellent CM-MS），並獲得了實際的應用與推廣。培養了一批對微流控芯片細胞分析有濃厚興趣的博士研究生和碩士研究生，部分畢業生或者在讀研究生積極參與本書的文獻調研和章節的撰寫。

本書是在林金明教授為清華大學本科生成功開設“微流控芯片細胞分析”課程的基礎上完成的。全書共有13章，每章緊密圍繞微流控技術、細胞分析、儀器研制以及分析方法學等研究內容。所有章節內容均由林金明教授統一確定、組織和安排，清華大學李楠博士、北京工商大學林玲教授負責本書的前期調研和文獻整理。各章內容分別由林金明與相關作者共同完成，李楠（第1章）、豐碩（第2章）、易伶潞（第3章）、張強（第4章）、黃秋實（第5章）、毛思鋒（第6章）、竇金鑫（第7章）、吳增楠和鄭亞婧（第8章）、張煒飛和李楠（第9章）、林玲（第10章）、周琳（第11章）、鄭亞婧和吳增楠（第12章）、許檸（第13章）。

書中每個章節既有獨立性又有相互的參考性，面向有一定化學、生物、醫學或者材料等相關專業基礎的高年級本科生為授課對像，也可以作為拓展研究生基礎知識的學習課程。我們希望這本書能夠幫助那些渴望了解更多有關微流控芯片和細胞分析相關知識的科研工作者和學生們，並與我們所研制的細胞分析微流控芯片-質譜聯用儀器進行配套，推動微流控芯片技術的快速發展。因此，本書既可作為高年級本科生儀器分析的參考資料或者新開設的教學課程用書，也可以作為研究生的專業課程用書，或者科研工作者的微流控細胞分析參考資料。

後，作者要衷心感謝本書中所有被引用論文的作者，他們的原創性研究是推動微流控細胞分析研究與應用發展的原動力。同時作者還要感謝國家自然科學基金（批準號：22034005，21727814，21435002，81373373，21227006，91213305，20935002，90813015，20775042，50273046）、國家重點基礎研究發展計劃（批準號：2007CB714507）以及國家重點研發計劃（批準號：2017YFC0906803）的經費支持，沒有這一繫列項目的長期持續的支持，不可能形成目前繫統的研究成果和已經商品化的微流控芯片質譜聯用細胞分析裝置。

由於筆者水平有限，編寫此書的時間也很倉促，書中難免出現失誤和引用不妥之處，望廣大讀者和被引用論文作者批評指正。



林金明李楠林玲

2021年5月6日