章大腸杆菌簡介 / 1



節大腸杆菌的理化特性1



一、分類與形態1



二、生長特性3



三、生化特性4



四、抵抗力4



五、抗原性4



第二節大腸杆菌與人體健康6



第三節動物性食品源大腸杆菌8



第四節動物性食品源大腸杆菌的檢驗12



主要參考文獻19







第二章動物大腸杆菌的感染與分離鋻定 / 21



節禽源大腸杆菌的分離鋻定21



一、河南21



二、河北22



三、黑龍江23



四、山東24



五、西藏24



六、湖南25



七、雲南25



八、江蘇26



九、湖北26



十、寧夏26



十一、甘肅26



十二、廣東27



十三、貴州27



十四、重慶27



十五、青海28



十六、山西28



十七、吉林28



十八、天津28



十九、遼寧29



二十、浙江30



二十一、四川30



二十二、陝西31



二十三、內蒙古32



二十四、福建32



第二節禽大腸杆菌的混合感染33



一、支原體與大腸杆菌混合感染33



二、新城疫混合大腸杆菌感染34



三、傳染性喉氣管炎病毒混合大腸杆菌感染35



四、傳染性支氣管炎病毒混合大腸杆菌感染35



五、球蟲與大腸杆菌混合感染36



六、維生素E缺乏癥並發大腸杆菌36



七、新城疫與大腸杆菌、支原體混合感染37



八、H9亞型禽流感病毒混合大腸杆菌感染37



九、大腸杆菌混合沙門氏菌感染37



十、大腸杆菌與葡萄球菌混合感染38



十一、傳染性法氏囊病混合大腸杆菌病39



十二、馬立克病混合大腸杆菌病感染39



十三、網狀內皮組織增生癥繼發大腸杆菌病39



十四、雞J亞群白血病繼發大腸杆菌感染40



十五、雞傳染性貧血繼發大腸杆菌感染40



十六、呼腸孤病毒病繼發大腸杆菌感染40



主要參考文獻40







第三章動物大腸杆菌的耐藥性 / 43



節藥敏試驗43



一、紙片法43



二、試管法48



三、常量肉湯稀釋法測定抗菌藥物抑菌濃度49



四、平板挖洞法50



五、微量肉湯稀釋法測定抗菌藥物抑菌濃度51



第二節禽大腸杆菌的耐藥性調查54



一、大腸杆菌的耐藥機制54



二、禽源大腸杆菌的耐藥性55



主要參考文獻66







第四章大腸杆菌的致病毒力因子 / 68



節大腸杆菌的致病因子68



一、菌毛69



二、細菌毒素70



第二節大腸杆菌毒力基因74



主要參考文獻75







第五章大腸杆菌病的臨床癥狀與病理病變 / 76



節豬大腸杆菌病的臨床癥狀與病理病變76



一、仔豬黃痢76



二、仔豬白痢78



三、豬水腫病79



第二節禽大腸杆菌病的臨床癥狀與病理病變82



主要參考文獻90







第六章大腸杆菌病的診斷 / 91



節流行病學診斷91



第二節實驗室診斷的基本方法92



一、病理組織學檢查93



二、微生物學診斷93



三、血清學試驗94



第三節細菌的分離培養與鋻定94



一、分離培養的注意事項94



二、分離培養的方法95



三、細菌的鋻定97



第四節免疫酶技術112



一、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked imlunosorbentesesy，ELISA)112



二、斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot-ELISA)114



三、大腸杆菌菌體蛋白質殘留量測定法115



第五節聚合酶鏈反應檢測技術116



第六節實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)119



一、iss基因119



二、cva基因120



三、cvaA基因120



四、cvaB基因120



五、cvaC基因121



六、cvi基因121



七、fimC基因121



八、fimD基因121



九、fimF基因122



十、fimH基因122



十一、fimG基因122



十二、fimB/fimD基因122



十三、uxaA基因123



十四、gntP基因123



十五、stx2A亞基基因123



十六、stx2 B亞基基因123



十七、hlyE基因124



十八、hlyC基因124



十九、hlyA基因124



二十、hlyB基因125



二十一、hlyD基因125



二十二、eae基因125



二十三、eatA基因125



二十四、eltA-不耐熱性腸毒素A亞基126



二十五、eltA-不耐熱性腸毒素B亞基126



二十六、toxA基因126



二十七、toxB基因127



二十八、aggA基因127



二十九、aggB基因127



三十、aggC基因127



三十一、aggD基因128



三十二、aggR基因128



三十三、ipaA基因128



三十四、ipaB基因129



三十五、ipaC基因129



三十六、ipaD基因129



三十七、tccP基因129



三十八、bfpA基因130



三十九、bfpB基因130



四十、bfpC基因130



四十一、bfpD基因131



四十二、bfpE基因131



四十三、bfpF基因131



四十四、bfpG基因131



四十五、bfpH基因132



四十六、bfpI基因132



四十七、bfpJ基因132



四十八、bfpK基因133



四十九、bfpL基因133



五十、bfpM基因133



五十一、aafA基因133



五十二、aap基因134



五十三、shf基因134



五十四、capU基因134



五十五、virK基因135



五十六、pic基因135



五十七、cdt-IIIA基因135



五十八、cdt-IIIB基因135



五十九、cdt～IIIC基因136



六十、astA基因136



六十一、repI基因136



六十二、papB～3基因136



六十三、afaA基因137



六十四、sfaH-3基因137



六十五、virF基因137



六十六、soxS基因138



六十七、soxR基因138



六十八、cadA基因138



六十九、cadB基因138



第七節環介導恆溫擴增PCR法139



第八節其他PCR技術140



一、多重PCR技術140



二、Tar916-shida PCR141



三、隨機擴增DNA多態性分型和隨機引物PCR分型技術141



四、低頻限制性位點聚合酶鏈反應142



五、多位點測序分型142



六、細菌基因組重復序列PCR技術分型143



七、PCR限制性片段長度多態性144



八、擴增片段長度多態性144



九、多位點數目可變串聯重復序列指紋圖譜分型145



第九節免疫組織化學方法146



一、免疫瓊脂擴散法146



二、乳膠凝集法146



三、放射免疫法147



第十節其他檢測診斷技術147



一、免疫印跡技術147



二、質粒及質粒圖譜分型148



三、染色體DNA限制性酶切分析149



四、色原或熒光底物及成套鋻定繫統150



五、核酸探針技術150



六、核糖體分型151



七、全細胞蛋白電泳圖譜分型152



八、高壓脈衝場凝膠電泳分型152



主要參考文獻153







第七章藥物控制研究 / 154



節大腸杆菌病西藥防治研究154



一、泵抑制劑154



二、單硫酸卡那霉素155



三、硫酸丁胺卡那霉素155



四、硫酸阿米卡星156



五、硫酸安普霉素156



六、氟喹諾酮藥物157



七、單諾沙星158



八、恩諾沙星乳酸鹽158



九、氟苯尼考159



十、頭孢拉定160



十一、頭孢噻呋鈉162



十二、喹賽多163



十三、氧氟沙星164



第二節大腸杆菌病中藥防治研究165



一、黃連、連翹、紫花地丁、黃芩和白頭翁165



二、銀花、黃連、五味子、連翹、大黃、黃芩、黃柏、白頭翁165



三、板藍根165



四、蒼術166



五、車前子提取物167



六、大蒜167



七、訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參168



八、低聚木糖168



九、黃連169



十、黃連解毒散169



十一、黃芩浸出液170



十二、苦參170



十三、烏梅化合物V171



十四、烏梅水煎液172



第三節大腸杆菌病聯合復方藥物或聯合用藥防治研究173



一、黃連組方口服液173



二、連葛口服液174



三、P10B抗菌肽和硫酸小檗堿174



四、阿莫西林和硫酸黏菌素175



五、腸安之星175



六、天南星、重樓、黃連、郁金、夏枯草、金銀花、黃柏、赤芍、川貝、甘草、梔子175



七、復方氟苯尼考口服液176



八、氟苯尼考與多西環素176



九、氟苯尼考與三甲氧苄啶177



十、復方制劑(氟苯尼考-硫酸黏菌素可溶性粉)177



十一、復方白頭翁顆粒177



十二、復方白頭翁散178



十三、白頭翁散 卡那霉素178



十四、硫酸阿米卡星復方制劑179



十五、復方磺胺二甲嘧啶鈉179



十六、復方鹽酸恩諾沙星可溶性粉180



十七、復方中草藥超微粉180



十八、復方中草藥181



十九、復方中藥制劑A181



二十、中草藥復方制劑-科力182



二十一、芩榆散183



二十二、禽菌敵184



二十三、舒安林184



二十四、速效畜禽康(復方煙酸諾氟沙星)185



二十五、細胞破壁中獸藥健雞散186



二十六、瀉康寧186



二十七、有效微生物菌群187



二十八、自擬中草藥復方188



二十九、中草藥方劑188



第四節大腸杆菌病其他藥物防治研究189



一、酵母培養物、糖萜素、益生素、甘露寡糖189



二、重組抗菌肽CecropinB190



三、抗菌脂肽提取物191



四、生物活性肽191



五、枯草芽孢杆菌E-8192



六、乳酸菌及其培養物193



七、乳酸菌發酵物與中藥配伍194



八、屎腸球菌195



九、消毒藥198



十、五加糖肽198



十一、增益素199



主要參考文獻201







第八章動物大腸杆菌病的預防和控制 / 204



節大腸杆菌疫苗研制204



一、菌種的分離鋻定205



二、疫苗菌株的篩選205



三、大腸杆菌菌種候選菌株的傳代205



四、大腸杆菌菌種候選菌株的毒力穩定性測定205



五、大腸杆菌病滅活疫苗基礎菌種的研究206



六、大腸杆菌病滅活疫苗的實驗室制備206



七、穩定性試驗207



八、大腸杆菌滅活疫苗的安全性試驗207



九、大腸杆菌病滅活疫苗對實驗動物免疫效力208



十、大腸杆菌病滅活疫苗效力檢驗的試驗208



十一、大腸杆菌病滅活疫苗的免疫期及抗體消長規律試驗208



十二、大腸杆菌母源抗體與試驗動物免疫的相關性研究208



十三、大腸杆菌病滅活疫苗的保存期試驗209



第二節禽大腸杆菌疫苗的研制與應用209



第三節大腸杆菌相關疫苗研發與生產數據215



一、已批準文號的大腸杆菌相關疫苗215



二、國內新獸藥注冊的大腸杆菌相關疫苗219



三、進口獸藥注冊的大腸杆菌相關疫苗220



四、臨床試驗審批的大腸杆菌相關疫苗221



第四節大腸杆菌防制措施221



一、滅菌和消毒222



二、定期免疫225



三、定期預防投藥225



四、添加劑225



五、治療226



六、加強監控226



七、實行全進全出制227



主要參考文獻227







後記 / 229

腸杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群革蘭氏陰性杆菌，根據細菌的生化反應、血清學試驗和DNA同源性特征，可將腸杆菌科至少分為28個菌屬和110個以上的菌種，包括腐生菌、寄生菌以及動物和人的病原菌。腸杆菌科細菌的分布十分廣泛，除了少數存在於植物、水和土壤中等自然界中之外，絕大多數大腸杆菌科細菌是人和動物腸道正常菌群的重要成員。在腸杆菌科細菌中，沙門菌屬、志賀菌屬以及埃希氏菌屬和耶爾森氏菌屬的部分菌屬對人或動物具有廣泛、不同程度的致病性，在醫學、公共衛生和獸醫臨診上都有重要意義。



大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)是埃希氏菌屬(Escherichia)中重要的代表菌種，一般將大腸埃希氏菌稱為大腸杆菌。德國科學家Escherich在1885年首次發現大腸杆菌，一般大腸杆菌不致病，並且隨後長期以來一直被認為大腸杆菌屬是人和動物腸道內正常菌群的重要成員之一，是人和動物腸道中的正常棲居細菌，維持著宿主腸道的正常生理功能。在一定條件下大腸杆菌可引起腸道外感染。在大腸杆菌屬中，有一部分血清型大腸杆菌菌株的致病性強，可引起人和動物腹瀉，統稱致病大腸杆菌。



大腸杆菌屬於革蘭氏陰性短杆菌，大小(1～3)微米×(0.4～0.8)微米。大腸杆菌周身有鞭毛，能運動，無芽孢，正常大腸杆菌菌屬能發酵多種糖類產酸、產氣。大腸杆菌是人和動物腸道中的正常棲居菌，自嬰兒出生後大腸杆菌隨哺乳進入腸道，與人終生相伴，大腸杆菌代謝活動能抑制腸道內分解蛋白質菌群的生長，減少蛋白質分解產物對人體的危害，還能合成維生素B和維生素K，同時產生有殺菌作用的大腸杆菌素。大腸杆菌在正常棲居條件下不會使得動物或人發病，但若進入宿主膽囊、膀胱等器官後可引起炎癥，大腸杆菌是兼性厭氧菌，在宿主腸道中可以大量繁殖，嚴重時大腸杆菌的量可以達到糞便干重的1/3。在不良的環境衛生情況下，常隨糞便散布在周圍環境中。如果在水和食品中檢出一定比例的大腸杆菌，可認為是被糞便大腸杆菌污染的指標，從而確認有腸道病原菌的存在。因此，大腸菌群數(或大腸菌值)常作為飲水和食物(或藥物)的衛生學標準指標之一。菌體抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)是大腸杆菌的抗原成分，這些復雜抗原成分具有抗機體吞噬和抗補體的能力。根據大腸杆菌菌體抗原的不同，可將大腸杆菌至少分為150多型，其中有一定數量的血清型屬於致病性大腸杆菌，常引起流行性嬰兒腹瀉或成人胸膜炎。大腸杆菌可作為研究微生物遺傳的重要材料，1954年在大腸杆菌K12菌株中發現的局限性轉導的研究開創了腸杆菌可作為微生物研究工具的先河。萊德伯格(Lederberg)利用兩株營養缺陷型大腸杆菌進行細菌接合實驗，該實驗奠定了大腸杆菌研究的基礎，以及後期的基因工程研究。作為人和許多動物腸道中主要且數量多的一種細菌，大腸杆菌主要寄生在大腸內，不良條件下大腸杆菌侵入人體一些部位時，有些感染可能是致命性的，尤其是對孩子及老人。致病性大腸杆菌可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等疾病。人在感染大腸杆菌後表現出胃痛、嘔吐、腹瀉和發熱等臨床癥狀。



在自然界的水中大腸杆菌可存活數周乃至數月，同時相對於其他腸道杆菌，大腸杆菌對熱的抵抗力比較強，55℃處理60分鐘或者60℃滅活15分鐘後仍有部分大腸杆菌存活，在溫度較低的糞便中存活時間會更久。膽鹽、煌綠等對大腸杆菌的生長表現出抑制作用。



大腸杆菌的菌毛和腸毒素是大腸杆菌的主要致病物質，稱為定居因子。此外，細菌胞壁脂多糖的類脂A具有毒性，大腸杆菌O特異多糖對宿主防御屏障具有抵抗作用。而大腸杆菌的K抗原有吞噬作用。



自1894年大腸杆菌病被報道以來，21世紀隨著養殖業的巨大發展，大腸杆菌病在各國流行日趨嚴重，並導致巨大的經濟損失。



大腸杆菌病主要由以下3種因素造成：



(1)免疫抑制因素機體的免疫功能主要分為體液免疫和細胞免疫。當免疫繫統受到其他疾病的破壞時，機體對其他疾病的抵抗力下降，大腸杆菌也就伺機入侵病體內。



(2)大腸杆菌病的傳播擴散主要受到環境因素影響氣候突變、氣溫降低、通風不良、空氣中氮氣濃度過高等，都能誘使畜禽抵抗力減弱，機體被病原微生物入侵，從而感染大腸杆菌病。



(3)大腸杆菌易產生耐藥性大腸杆菌對氯霉素、鏈霉素以及磺胺類藥物等表現出敏感，新霉素、慶大霉素也對大腸杆菌病有較好的臨床治療作用。但大腸杆菌極易產生耐藥性，雖然大腸杆菌的耐藥性機制不清楚，但大腸杆菌的耐藥性主要是由帶有R因子的質粒轉移而獲得的。臨床流行病學資料顯示，大腸杆菌對青鏈霉素、土霉素和四環素等抗菌藥物具有較高的耐藥性。在臨床實際生產中，由於操作人員盲目使用抗菌藥物治療疾病、隨意加大藥物使用量或者低劑量長時間使用某種藥物、未采用輪換用藥的方法，使得大腸杆菌耐藥性升高，導致藥物療效下降，造成不可挽回的損失。隨意使用各種抗生素藥物的同時也會導致畜禽體內微生物菌群失調，從而使宿主機體易感染大腸杆菌病。



由於大腸杆菌血清學復雜，且地域差異較大，目前臨床研究的大腸杆菌滅活菌體疫苗、脂多糖LPS疫苗、菌毛疫苗、鞭毛抗原H疫苗等對大腸杆菌病的防制效果不佳。因此，加強管理、搞好環境淨化、加強營養、飼喂配合飼料、保持合理飼養密度、減少各種應激反應、加強消毒以及科學使用抗生素是大腸杆菌病的防制工作中的一些基本措施。針對耐藥性的產生，研制出一種具有強烈、廣泛、交叉免疫保護性疫苗，能更好地防治大腸杆菌的各種感染，而采用疫苗預防和中草藥聯合控制大腸杆菌病的是一種可探索的方式。外膜蛋白是大腸杆菌的一種高度保守序列，能標志大腸杆菌遺傳多樣性，用相同引物對不同大腸杆菌菌株的外膜蛋白A基因序列進行聚合酶鏈式反應擴增，能夠產生完全相同的核苷酸序列。



本書參考和借鋻了國內眾多研究學者在人和動物大腸杆菌方面的報道文獻，以及部分來自於網絡的資料，在此，對文獻的作者表示衷心的感謝。全書采用羅列、融合和分塊整理方式，從動物大腸杆菌的病原學、分離鋻定、耐藥性、臨床癥狀、病理剖檢變化、診斷、致病機理以及藥物治療、疫苗研發應用等方面的研究進展進行編寫，重點論述大腸杆菌致病因子、雞和豬的主要大腸杆菌病感染和癥狀、中西醫治療和控制措施，有助於臨床上開展動物大腸杆菌病的全面防控。



後，謹希望本書的出版能夠更多的科研工作者關注動物大腸杆菌感染。同時，因知識和能力有限，雖然做了的努力，本書仍然存在許多疏漏之處，望廣大專家和讀者批評指正。







郭忠欣  王夢艷  劉兆陽



2019年4月10日