篇 概論

章 魚類性別特異分子標記篩選和性別控制概述

節 引言

魚類從受精卵發育到具有不同性別特征的個體是一個奇妙而又嚴謹的過程，是人類長期以來試圖揭示的自然現像。由於魚類在脊椎動物中承前啟後的特殊進化地位、龐大的種群數量及顯著的社會經濟價值，魚類性別決定機制、性別鋻定和控制技術的研究不僅對整個脊椎動物類群性別決定機制的形成及進化途徑的揭示具有非常重要的理論意義，而且由於許多魚類在生長速度上存在性別差異，通過性別鋻定和控制技術可以生產生長快速的全雌或全雄魚苗，這對於水產養殖業來說，具有重要的應用價值。

與高等脊椎動物相比，魚類的性別決定和分化具有多樣性、原始性和可塑性的特點，為魚類性別決定機制的闡明帶來了困難。首先，魚類的性別表現形式多樣，大多數魚雌雄異體，有些魚雌雄同體，有些魚能自然發生性逆轉（如黃鱔等），有些魚甚至能發生天然的雌核發育（如銀鯽）。其次，魚類進化的相對原始性，使得魚類幾乎包括了高等脊椎動物的所有性染色體類型，如XX/XY
型、XX/XO
型、ZW/ZZ型、ZO/ZZ型、W1W2Z/ZZ型、XY1Y2/XX型等。雖然已經對1700多種真骨魚類進行了染色體組型的研究，但在細胞遺傳學上能分辨出來的、具有異型性染色體分化的魚類大約隻有176種（DevlinandNagahama，2002）。再者，在魚類發育的早期，其自身內分泌的調節及外部環境因素（如水溫、光照、鹽度、pH
等）亦參與性別決定和分化，使得魚類性別具有較大的可塑性。魚類原發性性別形成後，在外源性激素、溫度等作用下可能通過某種途徑改變機體的新陳代謝，影響魚類的性別分化，使魚類性別決定機制更加復雜。根據魚類性別分化受外界環境溫度影響的程度，將魚類性別決定分為基因性別決定（geneticsexdetermination，GSD）和溫度依賴性性別決定（temperaturedependentsexdetermination，TSD）兩大類，前者性別分化受環境溫度的影響較小，而後者的性別分化受環境溫度的影響很大，已有報道表明多種魚類的性腺分化方向受到溫度影響，如鰈形目的牙鲆（Yamamoto，1999）、漠斑牙鲆（Luckenbachetal??，2003）魚苗在高溫和低溫環境中，產生生理雄性魚苗的比例均明顯增大，而隻有在中間溫度，雌雄魚苗的比例纔為1∶1，呈現一種U
形曲線。同時，還有一些魚類是通過溫度和基因型相互作用來決定性別分化的。不同魚類的性別決定類型不盡相同，需要進行實驗研究纔能確定一種魚類的性別決定類型。

魚類遺傳學研究及育種實踐中常常要求鋻別其性染色體組成，但是大多數魚類性染色體分化程度較低，而且性別分化在胚胎發育過程中易受環境影響，導致性表型與遺傳型不一致，因此，有必要發展一種可以識別其遺傳組成的簡便方法。找出性別特異的分子標記是一種較簡捷的鋻別方法。自從加拿大的Devlin等（1991）篩選到大麻哈魚Y染色體特異的DNA
片段以來，盡管國內外眾多學者在許多種魚類上開展了性別特異分子標記篩選的研究工作，但迄今也隻在虹鱒（Rachaeletal??，2003；Felipetal??，2005；Yanoetal??，2012）、青?（Matsudaetal??，1997，2002；Nandaetal??，2002；PatilandHinze，2008）、尼羅羅非魚（Leeetal??，2003）、半滑舌鰨（Chenetal??，2007，2012）、黃顙魚（Wangetal??，2009a）、銀鯽（Wangetal??，2009b）、圓斑星鰈（Maetal??，2010）等10多種魚類上篩選到性別特異分子標記。其中國內學者李靜等（2007）和馬洪雨等（2009）分別采用AFLP技術，利用選擇性引物組合（EGACT/MGCAA）從半滑舌鰨中篩選到一條雌性特異的AFLP標記，並成功地將其轉化為SCAR（sequencecharacterizedamplifiedregion）標記，建立了半滑舌鰨遺傳性別鋻定的分子生物學技術。因此，在篩選到性別特異分子標記的魚類中也基本建立了遺傳性別鋻定技術，從而為這些魚類的性別控制提供了有效的技術手段。

魚類性別控制是通過人為手段對魚類的生殖活動進行干預，使之按照人們的意願來繁殖所需性別後代的一種技術。性別控制時間分為受精之前和受精之後。前者是通過對精子的體外干預，使在受精之時便決定了後代的性別；後者是利用形態或者分子等手段對幼魚性別進行鋻定，從而獲得特定性別的後代。廣義的性別控制還包括遺傳型雌性向生理型雄性逆轉、遺傳型雄性向生理型雌性逆轉及不育魚的誘導等。人工控制魚類性別的方法和途徑主要有人工挑選法、種間雜交、激素處理、人工誘導雌核發育、人工誘導雄核發育、人工誘導三倍體、自身免疫閹割、外科手術閹割等，還可用電離輻射和化學絕育等方法產生中性不育魚。但比較有效的方法有種間雜交、激素處理、雌核發育和三倍體的人工誘導等。例如，中國水產科學研究院北戴河科學實驗站劉海金等建立了牙鲆雌核發育和全雌苗種培育技術（劉海金等，2010）；中國水產科學研究院黃海水產研究所陳松林實驗室建立了異源冷凍精子和同源精子誘導的半滑舌鰨雌核發育技術（Chenetal??，2009；Jietal??，2010a），構建了半滑舌鰨雌核發育群體；同時其實驗室又建立了半滑舌鰨三倍體魚苗及四倍體魚苗的誘導與鋻定技術（陳松林等，2011；李文龍等，2012），這些研究結果均為牙鲆及半滑舌鰨等重要經濟海水鲆鰈魚類的單性苗種培育、不育苗種培育等性別控制技術奠定了基礎。

第二節 魚類性別特異標記篩選和性別控制的目的和意義

一、魚類性別特異標記篩選和遺傳性別鋻定的目的和意義

由於魚類性別決定機制復雜，絕大部分種類沒有性染色體的分化，所以了解魚類性別和生殖的規律及其調控機制，對於發展魚類養殖具有重要的現實意義。在生長發育早期就能鋻定魚類遺傳性別將極大促進具有生長優勢性別的單性苗種培育進程，因此，篩選魚類性別相關分子標記、建立遺傳性別鋻別技術顯得極其重要。例如，通過篩選性別特異分子標記，建立遺傳性別鋻定技術，就可以將性逆轉的XY生理雌魚和XX雌魚區分開來，也可以將XY雄魚和YY超雄魚區分開來，這對於研制YY
超雄魚、培育XY全雄苗種至關重要。與此相類似，通過篩選W 染色體特異的雌性特異分子標記，可以建立ZW 雌魚、ZZ雄魚及WW
超雌魚鋻定的分子技術，從而為WW
超雌魚的研制及全雌苗種的生產提供技術手段。由此可見，性別特異分子標記的篩選對於魚類性別控制和單性苗種培育具有重要意義和應用價值。

二、魚類性別控制的目的和意義

魚類性別控制就是采用遺傳工程、細胞工程等生物學方法或物理、化學方法對魚類精子或卵子進行操作或處理，從而改變其產生的魚苗的性別比例，提高某種性別魚苗的比例，或培育出單性苗種的技術。由於許多魚類雌雄個體在生長性狀上存在明顯差異，所以，性別控制研究在魚類養殖和遺傳育種等領域具有重要意義，概括起來主要包括如下幾個方面。

（一）培育魚類單性苗種，提高魚類養殖產量

許多魚類在生長速度上存在雌雄差異。例如，羅非魚雄性個體生長比雌性個體快30%以上，虹鱒等鮭鱒魚類雌性個體生長比雄性個體快30%以上，鯉魚等魚類雌性個體比雄性個體生長快20%～30%。與淡水魚類相比，許多海水鰨、鰈和鲆魚類雌雄生長差異表現得更為突出。例如，條斑星鰈和大西洋牙鲆等鰈、鲆魚類雌性個體生長比雄性個體快30%～80%。而半滑舌鰨的雌雄生長差異表現得為明顯，其雌性個體比雄性個體生長快2～4倍。因此，對這些魚類開展性別控制和單性育種技術的研究，研制生長快速的單性群體，對於提高這些魚類的養殖產量和商品質量、提高水產養殖業的經濟效益至關重要。以半滑舌鰨為例，半滑舌鰨的雌性個體經過14～18個月的養殖後可以達到500～750g，而雄性個體在同樣養殖期內隻能達到150～200g，如能培育出半滑舌鰨全雌苗種，其養殖產量將提高60%～80%，其經濟效益也將大幅提高。相類似地，由於羅非魚雄性個體生長比雌性個體快30%以上，所以，培育羅非魚全雄苗種對於提高羅非魚養殖產量、提高經濟效益也具有重要意義和應用價值。

（二）控制養殖魚類的繁殖，調控養殖魚的密度

羅非魚目前是世界性養殖魚類，也是我國重要的淡水養殖魚類，我國每年羅非魚的產量高達100萬t左右。但由於羅非魚性腺發育速度快，魚苗經6～10個月養殖後就可以達到性成熟，達性成熟的魚以後每隔30～45天即可繁殖一次，養殖中易產生群體過密、個體小型化的現像，從而影響養殖產量和商品魚的質量，所以在羅非魚的養殖中，通過性別控制，養殖全雄單性群體對於控制羅非魚的繁殖力和密度、提高其產量和商品魚質量具有重要意義和應用價值。

（三）延長魚類有效生長期，提高魚類養殖產量

對於性周期較短，雌、雄性成熟年齡不同的魚類，培育單性苗種、實行單性養殖可延長魚的有效生長期，避免因性腺發育和成熟而降低生長速度。例如，大菱鲆和虹鱒雌魚一般為3齡達性成熟，而雄魚達性成熟隻需要兩年時間，由於性成熟早而影響雄魚的生長，若能培育和養殖全雌魚苗或使雄性魚苗轉化為雌性魚苗，那麼就可以延長有效生長期，達到大幅度增產的目的。

（四）培育繁殖用親魚，方便魚類人工繁殖

有些魚類是雌雄同體，其幼年時是一種性別，長大後則性逆轉為另一種性別。例如，石斑魚類，其低齡時為雌性，年齡增大後則轉為雄性，由於捕獲體重大的高齡雄魚十分困難，所以可采取性逆轉的方法，使雌魚提前發生性逆轉，將獲得的低齡成熟雄魚作為親魚，用於人工繁殖，從而解決人工育苗中需要大量雄性親魚的問題。又如，黑鯛在人工養殖條件下，2齡表現為雄魚，到3齡纔有少數轉化為雌魚。要獲得進行人工繁殖的雌魚，需要時間較長，而用性逆轉的方法，即可較快得到所需的雌魚。

（五）其他經濟目的

除以上各方面外，還有其他目的的性別控制。例如，多種觀賞魚雄魚色彩更為艷麗，具有更高的觀賞價值，利用性別控制生產更多的雄魚可增加收益。在向某地引入某種魚類，且不希望它在當地繁殖時，可采用隻引入雄性或雌性魚的方法，如美國引入草魚控制河道中的水草，就曾采用這樣的方法。

此外，作為古老脊椎動物的魚類，其性別決定的方式是多種多樣的，有很大的種間差異。魚類的性染色體或性別決定機制仍處於進化的早期階段，魚類是研究性別決定的良好素材，對魚類性別決定機制的研究，將給人類了解脊椎動物性染色體和性別決定機制的進化提供重要的基礎資料。

第三節 魚類性別特異標記篩選和性別控制的主要方法

一、魚類性別特異標記篩選的主要方法

（一）RAPD 方法

RAPD
（randomamplifiedpolymorphicDNA，隨機擴增多態DNA）是由Williams等和Welsh等於1990年發展起來的一項分子標記技術（Williamsetal??，1990；WelshandMcClell，1990），其原理是利用一繫列隨機合成的單個引物（大約為10個核苷酸），以研究對像的基因組DNA
為模板進行PCR擴增，當某一雙鏈DNA
分子上存在著與某一特定引物互補配對的反向對稱序列，且反向對稱序列之間的距離在200～4000bp的可擴增範圍之內時，就可擴增出DNA
片段。擴增產物經電泳分離和溴化乙錠（EB）染色，在紫外燈下觀察，根據DNA 條帶的多態性來反應模板DNA 序列上的多態性。

RAPD技術具有很多優點：①引物隨機，不需要預先了解目的基因和基因序列；②操作簡便，周期短，省時省力，易於程序化；③
靈敏度高；④RAPD 分析所需的DNA樣品量極少，這對於生物早期取樣鋻定或在DNA
受限制的情況下是十分有利的；⑤較高的檢出率，復性溫度低，能保證核苷酸引物與模板的穩定結合，同時允許適當的錯誤配對，擴大了引物在基因組DNA
中配對的隨機性。以隨機引物對生物樣本進行PCR擴增，不僅可以擴增出種內特異片段檢測種間多態性，而且可以擴增出個體所特有的片段檢測種內多態性，被廣泛應用於遺傳作圖、基因的快速定位、特殊染色區段的鋻定與分離、動物性別鋻定、動物育種及醫學診斷等領域。RAPD
技術基於上述優點，在魚類性別特異分子標記篩選中應用較多。例如，職金華等（2009）采用RAPD技術，篩選到泥鰍雄性特異分子標記1個；Casas等（2011）同樣利用RAPD技術篩選得到大菱鲆雌性特異標記3個，雄性特異標記1個。

（二）SSR 方法

SSR （simplesequencerepeat，簡單序列重復）也稱微衛星，是DNA
分子中的一個片段，由1～6個堿基對的核心序列串聯重復形成，其位點數目巨大並隨機分布於真核生物基因組中。每個特定的微衛星位點由核心區和側翼區兩部分組成，核心區含有多個拷貝的短序列，這些短序列重復次數和重復程度的不同造成了每個座位的多態性；側翼區保守性極高，在相近的物種中具有一定的保守性。SSR
標記的原理是：獲得微衛星序列，根據側翼序列設計引物，以研究對像基因組DNA 為模板進行PCR
擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺凝膠電泳，然後采用紫外燈或者銀染顯示條帶進行分析。

SSR技術具有以下的優點：①可檢測出比RAPD 更多的多態性，數量豐富，覆蓋整個基因組，具有廣泛的位點變異；②SSR
標記為共顯性標記，以孟德爾方式遺傳，能夠區分純合型和雜合型，提供完整的遺傳信息；③具有多等位基因的特性，提供的信息量高；④微衛星序列多態性可以用PCR
方法檢測，對DNA
模板的要求不高，重復性好等。因此，被廣泛應用於物種多樣性、群體遺傳結構、種群親緣關繫、遺傳圖譜的建立及動物性別鋻定等領域。黃海水產研究所Chen等（2012）通過半滑舌鰨雌雄魚全基因組測序與比對，篩選到雌性特異的微衛星標記159個，並對其中一個性別連鎖微衛星標記進行了序列分析和驗證，表明該標記在ZW
雌魚基因組中為a 和b 兩個等位基因，在ZZ雄魚基因組中為一個b 等位基因，而在WW 超雌魚基因組中為一個a
等位基因，據此建立了半滑舌鰨ZZ雄魚、ZW 雌魚和WW
超雌魚鋻定的分子技術，為半滑舌鰨超雌魚鋻定提供了有效手段，大大推進了半滑舌鰨性別控制的研究進程。

（三）AFLP方法

AFLP
（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，擴增片段長度多態性）是1993年由ZabeauMarc和VosPieter基於PCR技術發明創建的一種DNA
分子標記技術，其原理是研究對像的總基因組DNA
經限制性內切酶充分消化後，在限制性片段兩端連接上人工接頭作為擴增的模板，引物與酶切位點及接頭序列互補，並且3′端有2～3個選擇性堿基，對於復雜的基因組DNA，要經過連續兩次PCR擴增，即預擴增和選擇性擴增，預擴增引物隻含一個選擇性堿基，選擇性擴增引物含2～3個選擇性堿基，擴增結果利用聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，尋找多態性擴增片段。AFLP技術是基於對基因組DNA
的分析而創建的，目前已有cDNAGAFLP，還有甲基化敏感GAFLP。

AFLP技術主要優點為：①所需DNA 量少，DNA
濃度變化對反應的影響不大；②多態性強，擴增效率高，引物設計巧妙、搭配靈活，是所有分子標記中多態片段和信息量檢測效率的；③可重復性好，結果穩定可靠；④適合於變性序列在凝膠上的電泳分離，分辨率高；⑤AFLP標記呈典型的孟德爾遺傳，定位專一；⑥樣品適用性廣，用同樣一套限制酶、接頭和引物，可對各種生物的DNA
進行分子遺傳標記研究。

AFLP不需要知道所研究對像的DNA
序列，而且一對合適的引物可在一次反應中檢測到大量的片段，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的靈敏性，而且克服了二者的缺點，是當前為有效的分子標記方法，被廣泛應用於基因鋻定、遺傳育種、多態性分析、動物性別鋻定等領域。在國內外，目前AFLP是在性別特異分子標記的篩選中應用多的技術，但是也隻有少數學者篩選得到性別特異標記。例如，Chen等（2007）利用AFLP技術篩選得到半滑舌鰨雄性特異標記7個，並廣泛應用於半滑舌鰨育種中，了大量的人力、物力；Ma等（2009）利用AFLP技術篩選得到圓斑星鰈雌性特異標記2個。

（四）SNP方法

SNP
（singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態性）為個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異（替代、插入或缺失）所引起的多態性，即基因中的點突變。

SNP作為一種新的遺傳標記相比於其他標記有如下特點：①一般來說，一個SNP位點隻有兩種等位基因，因此又叫雙等位基因，易於基因分析，雖然也可能是3個或4個等位多態性，但非常少見，幾乎可以忽略；②在基因組中的發生頻率比較高，有些SNP位點還影響基因的功能；③遺傳穩定性高；④適於快速、規模化篩查，有利於發展自動化技術，有望分析成千上萬的SNP，可大大豐富既有的連鎖圖。自Lander於1996年次提出SNP作為新一代分子標記後，科學家對SNP的研究越來越多，而且其也已開始應用於性別特異分子標記的研究，如Kamiya等（2012）報道采用SNP標記得到紅鰭東方?雌性特異標記1個。

（五）SRAP方法

SRAP
（sequenceGrelatedamplifiedpolymorphism，相關序列擴增多態性）標記通過特殊的雙引物設計對基因的可讀框進行擴增，上遊引物對外顯子區域擴增，下遊引物對內含子區域、啟動子區域進行擴增，因個體不同，以及物種的內含子和啟動子及二者間隔長度不等而產生多態性，提高了擴增結果與表型的相關性。

SRAP由美國Li與Quiros博士於2001年在芸薹屬作物中開發出來，以後因具有以下優點而被廣泛應用於植物的遺傳多樣性研究中，其優點如下：①簡便、快捷、高效；②DNA
需要量少，不需預知物種的序列信息；③多態性強，共顯性高；④重復性好，標記分布均勻，產率高；⑤易測序，便於克隆目標片段，且花費較少。SRAP在水產動物研究中應用相對較少，在今後的應用中具有很大的潛力，目前已有學者將SRAP技術成功應用於魚類性別特異標記的篩選，如辛文婷等（2009）采用SRAP分子標記技術，共使用140對引物進行了黃顙魚性別表達特征性序列的篩選研究，並且獲得黃顙魚雄性特異標記1個。