作為一部以黃酮類化合物為主要研究對像的合成生物學制造的專著，本書結合作者團隊在執行國家973 計劃、863 計劃、國家自然科學基金項目和江蘇省自然科學基金重點項目等的研究實例（博碩士論文），針對微生物法合成黃酮類天然產物過程中的關鍵科學問題，從黃酮類化合物的高效合成代謝途徑發掘及構建、黃酮類化合物生物合成代謝途徑調控原理及應用、代謝網絡調控新方法及其應用等方面，較為繫統地闡述了合成生物學方法生產目標產物的關鍵技術優勢。本書內容注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性。

本書不僅可以為從事植物天然產物研究的讀者提供參考，也可以為從事代謝工程與合成生物學生產其他產物的讀者提供分析問題和解決問題的思路與方法。

章黃酮類化合物簡介  001

1.1黃酮類化合物  004

1.1.1黃酮類化合物的基本特性  004

1.1.2黃酮類化合物的種類  004

1.1.3黃酮類化合物的功能及市場  007

1.2黃酮類化合物的生產技術  010

1.2.1黃酮類化合物提取法生產技術  010

1.2.2黃酮類化合物化學法合成技術  014

1.2.3酶催化生物合成黃酮苷  018

1.2.4黃酮類化合物的微生物法生產技術  022



第二章黃酮類化合物合成代謝途徑的挖掘與構建  029

2.1概述  029

2.1.1黃酮平臺化合物柚皮素和生松素的合成代謝途徑  029

2.1.2常見的黃酮類化合物修飾途徑  030

2.2 組學技術驅動的水飛薊賓原生合成途徑的解析  032

2.2.1不同植物組織水飛薊賓及其前體含量差異性分析  034

2.2.2水飛薊賓合成過程的轉錄組學分析差異基因  036

2.2.3體外仿生研究及水飛薊賓全合成途徑的解析  041

2.3黃酮類骨架物質合成途徑的異位重構  047

2.3.1基於定點突變技術的途徑基因挖掘  048

2.3.2基於生物信息學分析的途徑基因挖掘  049

2.3.3基於四質粒共表達體繫的合成途徑構建與產物分析鋻定  049

2.4大腸杆菌生產黃酮類物質聖草酚的研究進展  051

2.4.1大腸杆菌以L- 酪氨酸為底物生產聖草酚的機理  051

2.4.2大腸杆菌生產黃酮類化合物聖草酚的國內外研究現狀  052

2.5 代謝工程技術強化大腸杆菌胞內丙二酰輔酶A 的研究進展  053

2.5.1丙二酰輔酶A 在聖草酚合成中的重要性  053

2.5.2代謝工程技術強化大腸杆菌胞內丙二酰輔酶A 的研究現狀  053

2.5.3代謝工程技術強化丙二酰輔酶A 的積累  054

2.5.4 可溶性表達黃酮3' - 羥化酶（F3' H）融合蛋白及平衡相應基因表達  057

2.5.5重組菌的發酵條件優化與控制  061

2.5.6優化條件下聖草酚產量與輔酶A 含量  064

2.5.7基於高效黃酮3' - 羥化酶鋻定的黃杉素合成途徑的挖掘  066

2.5.8SmF3H 的序列分析  067

2.5.9SmF3H 的功能鋻定  069

2.5.10基於啟動子優化SmF3H 表達水平  069

2.5.11在5L 發酵罐水平進行黃杉素發酵優化  070

2.6黃杉素從頭合成途徑的構建與優化  072

2.6.1黃杉素及其微生物法合成  072

2.6.2微生物法合成黃杉素的現狀與趨勢  072

2.6.3微生物法高效合成黃杉素意義  078

2.6.4黃杉素從頭合成途徑在解脂亞洛酵母中的重構  079

2.6.5黃杉素合成途徑限速步驟分析與模塊化優化  082

2.6.6通過強化前體代謝流提高黃杉素合成效率  084

2.6.7發酵條件優化  086

2.7小結  087



第三章黃酮類化合物從頭合成代謝途徑的構建  089

3.1 基於高效酶級聯轉化體繫的松柏醇全合成途徑的構建  089

3.1.1過氧化氫對香草醇氧化酶的抑制及松柏醇的過度氧化作用  090

3.1.2過氧化氫酶的表達與分析  092

3.1.3強化過氧化氫酶活性的松柏醇酶級聯轉化體繫分析  093

3.1.4體繫條件優化及3L 發酵罐發酵  093

3.2高效水飛薊賓體外合成新途徑構建  096

3.2.1過氧化物酶的選擇及其催化水飛薊賓合成的功能分析  097

3.2.2酶級聯的設計與構建  100

3.2.3血紅素合成過程的強化  102

3.2.4體外反應條件優化  102

3.3基於限速分析的柚皮素從頭合成途徑的構建  106

3.3.1柚皮素從頭合成菌株的構建  107

3.3.2莽草酸途徑對柚皮素積累的影響  109

3.3.3外源基因表達強度對柚皮素積累的影響  110

3.3.4發酵罐水平優化柚皮素積累  110

3.4益生酵母的對香豆酸合成途徑的構建  111

3.4.1對香豆酸及其衍生物  111

3.4.2對香豆酸及其衍生物的生物合成  113

3.4.3釀酒酵母合成天然產物  119

3.4.4產對香豆酸釀酒酵母工程菌株的構建  122

3.4.5釀酒酵母生產對香豆酸合成途徑的優化  126

3.4.6釀酒酵母生產對香豆酸的發酵優化  131

3.5基於酵母整合包的黃杉素從頭合成途徑構建  135

3.5.1構建Ty 表達包  137

3.5.2Ty 表達包的整合能力驗證  138

3.5.3單位點Ty 整合菌株生產能力的鋻定  140

3.5.4丙二酰輔酶A 途徑對柚皮素和黃杉素積累的影響  141

3.5.5三位點Ty 整合菌株從頭合成黃杉素的能力  142

3.5.6在5L 發酵罐中從頭合成黃杉素  144

3.6小結  144



第四章黃酮類化合物代謝途徑的理性調控策略  147

4.1概述  147

4.1.1微生物代謝途徑的傳統調控方法  147

4.1.2微生物代謝途徑的精細調控策略  148

4.2基於模塊化代謝途徑關鍵基因上調策略  148

4.2.1黃酮骨架物質總合成途徑的模塊劃分  148

4.2.2黃酮骨架物質總合成途徑的瓶頸步驟分析  149

4.2.3特異模塊的精細劃分改造瓶頸步驟  150

4.2.4模塊化的單獨優化  151

4.2.5芳香族氨基酸合成黃酮骨架物質途徑的整合  152

4.3基於內源啟動子的基因上調策略  154

4.3.1啟動子-5' - 非轉錄區域（PUTR）文庫篩選與準備  154

4.3.2PUTR 轉錄特性研究  157

4.3.3細胞生長不同時期PUTR 蛋白質表達特性研究  158

4.3.4相同PUTR 熒光蛋白表達與mRNA 轉錄水平對比  159

4.3.5啟動子工程構建高強度PUTR  161

4.3.6工程化PUTR 普適性研究  163

4.4 基於反義RNA 的脂肪酸代謝途徑關鍵基因下調策略  164

4.4.1起始反義RNA 表達繫統的構建  165

4.4.2反義RNA 不同結合區域對抑制效率的影響  166

4.4.3反義RNA 繫統對於胞內脂肪酸含量的影響  168

4.4.4反義RNA 繫統協同抑制fabB 和fabF 基因  168

4.4.5反義RNA 繫統對胞內丙二酰輔酶A 濃度的影響  170

4.4.6反義RNA 繫統對柚皮素產量的影響  171

4.4.7反義RNA 繫統對生松素產量的影響  172

4.5 基於CRISPR/dCas9 的中心代謝途徑關鍵基因下調策略  174

4.5.1CRISPR 干擾繫統的構建  176

4.5.2利用CRISPR 干擾繫統鋻定出與丙二酰輔酶A 合成相關的基因  177

4.5.3菌體生長和丙二酰輔酶A 合成的協調  178

4.5.4單個基因抑制對於柚皮素產量的影響  181

4.5.5多個基因抑制對於柚皮素產量的影響  182

4.5.6單個或多個基因抑制對於生松素產量的影響  182

4.6小結  184



第五章黃酮類化合物合成過程的半理性調控策略  187

5.1概述  187

5.1.1黃酮及其中間代謝產物的高效檢測方法  187

5.1.2微生物高效積累目標產物的高通量篩選策略  187

5.2 定向改造技術驅動的高效對香豆酸合成菌株的構建  188

5.2.1對香豆酸簡介  188

5.2.2酪氨酸解氨酶的研究進展  189

5.2.3定向進化方法概述  191

5.2.4酪氨酸解氨酶高通量篩選方法的建立  192

5.2.5隨機突變改造酪氨酸解氨酶  197

5.2.6突變位點的單一及疊加突變與分析  201

5.3 黃酮類化合物及其中間代謝產物的半理性篩選策略  205

5.3.1柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的紫外- 可見光光波譜學特性  206

5.3.2柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的熒光光譜學特性  206

5.3.3柚皮素檢測條件優化  208

5.3.4中間產物干擾性驗證  209

5.3.5TtgR 對柚皮素濃度響應特性研究  210

5.3.6基於TtgR 的超高通量篩選方法  211

5.3.7質粒文庫多樣性驗證  213

5.3.8柚皮素高產菌株輪高通量篩選  216

5.3.9柚皮素高產菌株迭代高通量篩選  217

5.3.10柚皮素合成關鍵代謝節點解析  218

5.4小結  219



第六章黃酮類化合物生物合成途徑的動態調控策略  221

6.1概述  221

6.1.1代謝網絡的動態調控策略  221

6.1.2生物傳感器及其在代謝網絡調控中的應用  222

6.2 基於CRISPRi 的脂肪酸動態調控黃杉素前體代謝途徑  223

6.2.1隨機和定點整合方法的構建  224

6.2.2脂肪酸誘導型啟動子分析  228

6.2.3sgRNA 單靶點阻遏效果分析  228

6.2.4多基因組合阻遏效果分析  230

6.2.5脂肪酸合成動態調控下黃杉素與脂肪酸合成  231

6.3柚皮素合成過程的動態調控  232

6.3.1柚皮素響應啟動子結構研究  233

6.3.2對香豆酸響應啟動子結構研究  235

6.3.3柚皮素動態調控模塊放大效應  236

6.3.4脂肪酸代謝途徑優化  238

6.3.5丙二酰CoA 來源代謝途徑優化  240

6.3.6雙動態調控繫統組合發酵  242

6.3.7文庫構建與轉化效率檢測  243

6.3.8高通量篩選柚皮素高產菌株  243

6.4小結  248



第七章黃酮類化合物轉運途徑的發掘  251

7.1概述  251

7.1.1苯丙素類化合物簡介  251

7.1.2利用大腸杆菌生產苯丙素類化合物的可行性及限制因素  252

7.2膜蛋白質組學  254

7.2.1蛋白質組學簡介  254

7.2.2蛋白質組學的主要研究技術及技術路線  255

7.2.3蛋白質組學在大腸杆菌中的應用  258

7.3 大腸杆菌AraE 蛋白對苯丙素類化合物轉運的情況  259

7.3.1araE 基因過量表達和基因沉默菌株構建及驗證  259

7.3.2過量表達和沉默araE 基因對大腸杆菌苯丙素類化合物轉運的影響  260

7.4E .coli BL21（DE3）膜蛋白質組學雙向電泳方法優化  262

7.4.1不同蛋白質純化方法對雙向電泳結果的影響  262

7.4.2不同凝膠參數的確定  263

7.5 不同苯丙素類化合物刺激下E.coli BL21（DE3）膜蛋白質組學研究結果  264

7.5.1不同苯丙素類化合物對E.coli BL21（DE3）膜蛋白表達的影響  264

7.5.2差異表達蛋白質的鋻定及鋻定結果分析  266

7.5.3關鍵差異蛋白質的分析及定量PCR 驗證  269

7.6E.coli BL21（DE3）中鋻定關鍵膜蛋白對苯丙素類化合物耐受性的影響  270

7.6.1關鍵蛋白質基因過量表達菌株的構建  270

7.6.2 過量表達膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響  271

7.6.3關鍵蛋白質基因沉默菌株的構建  274

7.6.4 沉默膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響  277

7.7小結  279



第八章合成生物學制造黃酮類天然產物的工業化展望  281

8.1化學品綠色制造核心技術——合成生物學  281

8.2合成生物學與代謝工程育種新方法  281

8.2.1代謝途徑精細調控策略的深入研發  281

8.2.2合成生物學在微生物繫統定向進化中的應用  283

8.2.3體外合成生物學的應用  287

8.3展望  290



參考文獻  292

發酵工程是當代工業生物技術的重要領域和組成部分。繫統生物學、代謝工程和合成生物學技術的飛速發展，使得人們可以采用更多的策略改造微生物生產更多種類的目標產物，極大地拓展了發酵工程的應用範圍。

黃酮類化合物是一類重要的植物次級代謝產物，廣泛存在於植物的各種組織中，幫助植物抵抗細菌、真菌等侵入，是植物防御繫統的重要組成部分。花青素類黃酮類化合物賦予植物花、果實、葉子等以豐富多彩的顏色。黃酮類化合物種類繁多，已經被鋻定的種類超過5000 種，很多具有非常重要的用途。黃酮類化合物具有多種調節人體生理功能的特性，如水飛薊賓和二氫楊梅素等可以緩解肝髒毒性，大豆異黃酮等可以減輕更年期癥狀，淫羊藿苷等可以預防中老年骨質疏松癥等。由於天然植物中黃酮類化合物的含量普遍較低，導致價格奇高、供應短缺，嚴重限制了很多具有明確功能的黃酮類化合物在食品、醫藥、飼料和化妝品中的廣泛應用。黃酮類化合物由於代謝途徑長、前體來源多，也被很多研究者作為合成生物學研究的一類重要目標產物，建立了很多重要的合成生物學理論與方法。

作者團隊自2010 年開始，在國家973 計劃、863 計劃、國家自然科學基金項目、江蘇省自然科學基金重點項目等的支持下，利用繫統生物學方法挖掘水飛薊賓和淫羊藿苷等復雜黃酮類化合物的合成代謝途徑，開發靜態和動態精細調控策略優化黃酮類化合物合成代謝途徑，結合對轉運途徑的分析和發酵過程優化，實現了多種黃酮類化合物的高效合成，形成了4 篇博士學位論文和6 篇碩士學位論文，這些學位論文正是本書的主體。研究工作也得到了美國唐納德植物科學中心（McDonald Danforth Plant Science Center）的Oliver Yu 教授、倫斯勒理工學院（Rensselaer Polytechnic Institute）的Mattheos AG Koffas 教授、得州大學奧斯汀分校（University of Taxas at Austin）的Hal Alper 教授、馬裡蘭大學巴爾的摩分校（University of Maryland at Baltimore County） 的Peng Xu 博士等的大力支持。在本書編寫工作中也大量參考了近年來在國內外學術期刊、行業期刊、相關專著以及互聯網發表的研究論文、綜述文章和市場分析等成果，在此一並致謝。作者以黃酮類化合物為載體，運用了大量的生物技術理論與方法，相信本書不僅可以為從事植物天然產物研究的讀者提供參考，也可以為從事代謝工程與合成生物學生產其他產物的讀者提供分析問題和解決問題的思路與方法。

參與本書中部分章節寫作的有：周景文、陳堅、吳俊俊、呂永坤、周勝虎、高松、朱賽傑、王奎、劉沛然、張思琪、李廣健等。作者特別感謝中國工程院院士、江南大學生物工程學院倫世儀教授的鼓勵和指導，感謝所在研究室的老師、博士後、博士和碩士研究生給予的幫助。

作者力圖在本書中注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性，但限於作者的學術功底、研究經驗和寫作能力，書中存有疏漏和不妥，若蒙賜教，不勝感激！



作者

2021 年10 月