《生物化學與分子生物學實驗技術》一書對實驗安全知識和生物大分子的制備作了全面扼要的介紹，並著重介紹了常用生物化學和生物大分子學實現技術,共十七章。內容包括光譜分析技術、色譜技術、膜分離技術、離心技術、電泳技術、核酸操作技術、基因文庫技術、聚合酶鏈式反應擴增技術、重組DNA技術、外源基因表達技術、基因沉默技術、DNA序列測定技術、分子雜交技術和生物芯片技術的基本原理和實驗方法，同時對生物信息學技術進行了簡明扼要的介紹。

《生物化學與分子生物學實驗技術》可作為高等院校生物工程、生物技術、食品科學與工程、生物制藥、動物醫學、動物科學、發酵工程、衛生檢驗和醫學等專業的教材，也可供相關專業的學生、教師和科研工作者參考。

蔡勇，西北民族大學生命科學與工程學院，實驗室主任、副教授、碩導，主要教學經歷

2005.7——  擔任動物醫學本科專業、動物科學本科專業的《動物生物化學》課程

2007.1——  擔任生物工程本科專業、生物技術本科專業的《生物化學》課程

2009.1——  擔任基礎獸醫、預防獸醫、臨床獸醫、動物遺傳育種與繁殖、動物營養和特種經濟動物養殖碩士研究生的《高級生物化學》課程

科學研究、實踐經歷

自2005年工作以來，一直從事生物化學與分子生物學的教學與科研工作，先後承擔西北民族大學教改項目2項；主持或參與國家自然科學基金、甘肅省科技支撐計劃、甘肅省農牧廳生物技術專項、蘭州市科技計劃項目和中央高校基本業務費科研項目等15項，獲甘肅省高校科技進步一等獎1項，甘肅省科技進步三等獎1項。

章生物化學及分子生物學實驗基本操作技術

節生物化學及分子生物學實驗技術發展簡史1

一、生物科學發展簡史1

二、生物化學發展簡史3

三、我國生物化學的發展4

第二節實驗室規則及安全防護4

一、實驗室規則4

二、有害化學物的處理5

三、實驗室安全及防護知識6

第三節常用器皿的使用10

一、常用玻璃量器的規格10

二、常用器皿的清洗10

三、玻璃儀器的干燥11

四、清洗液的種類及配制11

五、玻璃儀器的使用12

六、常用玻璃量器的校正12

第四節移液器的種類和使用13

一、滴管13

二、吸量管13

三、微量進樣器15

四、自動移液器16

第五節溶液的混勻17

一、攪拌法17

二、旋轉法18

三、彈打法18

四、離心法18

五、吹打法18

六、渦旋法18

七、振蕩器混勻法19

第二章生物大分子制備技術

節生物材料的選擇與采集20

一、生物材料的選取20

二、生物材料的采集與保存20

三、生物材料的預處理21

第二節組織及細胞的破碎23

一、機械破碎法23

二、物理破碎法24

三、化學破碎法25

四、酶學破碎法25

第三節生物大分子的提取26

一、活性物質的保護措施26

二、影響提取的因素27

第四節生物大分子的分離、純化和定量29

一、分離純化原理29

二、分離純化方法的選擇與分離程序30

三、目標物質初分離30

四、目標物質的純化與純度鋻定31

第五節濃縮、干燥及保存33

一、制品的濃縮33

二、制品的干燥33

三、制品的保存34

第三章光譜分析技術

節紫外-可見吸收光譜分析35

一、光譜產生的過程35

二、光譜的分類36

三、常用吸收光譜分析術語37

四、朗伯-比爾定律39

五、紫外-可見分光光度計的基本構造39

六、紫外-可見分光光度計的分類41

七、紫外-可見吸收光譜分析方法41

八、紫外-可見吸收光譜分析的影響因素44

九、可見光比色分析條件的選擇46

第二節熒光光譜分析技術47

一、熒光分析的基本原理47

二、相關概念和參數47

三、熒光儀器的基本結構及光電繫統48

四、熒光分析的應用49

第三節原子吸收光譜分析技術51

一、原子吸收分光光度計的原理51

二、原子吸收光譜的產生51

三、基態原子數和激發態原子數的關繫52

四素的定量52

五、原子吸收光譜分析的優點52

第四章色譜技術

節色譜技術分類53

一、按固定相和流動相所處的狀態分類53

二、按色譜分離原理分類54

三、按實驗技術分類54

四、根據操作方式分類55

第二節層析的基本理論55

一、分配繫數56

二、阻滯因數或Rf57

三、洗脫體積Ve57

四、色譜法的塔板理論57

五、色譜圖59

六、分離度60

七、色帶的變形和“拖尾”61

第三節柱色譜繫統基本操作方法62

一、裝柱62

二、平衡63

三、上樣量和上樣體積63

四、洗脫64

五、流速及控制65

六、分部收集66

七、檢測和合並收集66

八、洗脫峰的純度鋻定66

九、脫鹽和濃縮67

第四節常用的色譜方法67

一、吸附色譜法67

二、分配色譜法73

三、凝膠色譜法76

四、離子交換色譜法79

五、親和色譜技術84

六、薄層色譜法88

七、氣相色譜99

八、高效液相色譜102

第五章膜分離技術

節過濾109

一、過濾的分類110

二、過濾裝置110

三、過濾的操作過程111

第二節半透膜分離技術111

一、膜分離技術概況111

二、膜分離技術基本原理112

三、膜的性質112

四、分離方式112

五、透析袋的處理、保存113

第三節微濾114

一、微濾的基本概念和分離範圍114

二、微濾的操作模式114

第四節超濾技術115

一、超濾裝置與工作原理115

二、影響超濾的幾個因素117

三、超濾技術的應用117

第六章離心技術

節離心技術基本原理118

一、離心力和相對離心力118

二、沉降速度120

三、沉降繫數120

四、離心時間120

第二節離心機的主要構造和分類120

一、制備型離心機121

二、分析型離心機123

第三節離心的基本方法123

一、沉澱離心124

二、差速沉降離心法124

三、密度梯度區帶離心法124

四、連續流離心126

五、分析超離心126

第四節離心操作注意事項127

第七章電泳技術

節電泳技術概況及基本原理128

一、電泳技術發展簡史128

二、電荷的來源129

三、泳動度129

四、影響電泳的因素130

五、電泳的分類131

第二節紙電泳132

第三節醋酸纖維素薄膜電泳132

一、原理及特點132

二、操作要點133

三、應用133

第四節瓊脂糖凝膠電泳133

一、瓊脂糖凝膠的特點133

二、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關繫134

三、核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關繫134

四、瓊脂糖凝膠電泳基本方法簡介134

第五節聚丙烯酰胺凝膠電泳135

一、聚丙烯酰胺凝膠聚合原理及相關特性135

二、常規聚丙烯酰胺凝膠電泳137

三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳140

四、聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳141

五、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳143

六、聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳148

第六節染色方法151

一、蛋白質染色151

二、糖蛋白染色153

三、脂蛋白染色154

四、核酸染色154

五、同工酶染色156

第七節毛細管電泳157

一、毛細管電泳的基本原理157

二、毛細管電泳的類型158

三、毛細管電泳裝置159

四、幾種毛細管電泳分離模式的基本原理160

五、毛細管等速電泳162

第八節其他電泳技術163

一、免疫電泳163

二、單細胞電泳165

三、脈衝凝膠電泳165

四、印跡轉移電泳166

五、溫度梯度凝膠電泳166

六、逆向色譜電泳166

七、介體電泳167

第八章核酸操作基本技術

節核酸的提取與純化168

一、基本原理168

二、微生物DNA的提取169

三、動物細胞DNA的提取172

四、植物細胞核DNA的提取173

五、核外DNA的提取175

六、RNA的提取177

第二節核酸的檢測與保存180

一、核酸的檢測180

二、核酸的保存182

第三節核酸的凝膠電泳183

一、瓊脂糖凝膠電泳183

二、聚丙烯酰胺凝膠電泳185

第九章基因文庫技術

節基因組文庫的構建186

一、載體的選擇187

二、基因組DNA的制備187

三、基因組DNA的處理187

四、載體與外源DNA的連接188

五、重組DNA的體外包裝和轉入宿主細胞188

六、文庫的檢測、擴增和保存188

第二節cDNA文庫的構建189

一、cDNA文庫構建的基本原理與方法189

二、cDNA全長文庫189

三、cDNA文庫質量評價190

四、cDNA文庫的其他類型191

第三節基因文庫的擴增和保存192

第四節克隆基因的分離與鋻定193

一、通過重組體表型特征進行篩選鋻定193

二、通過重組DNA分子結構特征進行篩選鋻定194

三、通過外源基因的表達產物進行篩選鋻定194

四、cDNA文庫分離新基因的方法195

第十章聚合酶鏈式反應擴增技術

節聚合酶鏈式反應擴增原理197

第二節PCR反應體繫198

一、引物198

二、底物（dNTP）199

三、模板199

四、Taq DNA聚合酶199

五、PCR緩衝液200

六、鎂離子200

第三節PCR反應條件的選擇200

一、溫度循環參數200

二、PCR反應動力學201

第四節PCR引物及其設計201

一、PCR引物設計的基本原理201

二、引物設計軟件203

第五節常用的PCR方法203

一、原位PCR203

二、逆轉錄PCR204

三、實時定量PCR206

四、甲基化PCR207

五、巢式PCR208

第六節PCR技術的應用209

一、核酸的基礎研究209

二、序列分析210

三、檢測基因表達210

四、從cDNA庫中放大特定序列210

五、研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段210

六、進化分析210

七、醫學應用211

八、分析生物學證據211

九、性別控制211

十、轉基因檢測211

第十一章重組DNA技術

節分子克隆常用的工具酶213

一、限制性核酸內切酶214

二、DNA聚合酶215

三、DNA連接酶216

四、核酸酶217

五、堿性磷酸酶220

第二節目的基因的獲取221

一、直接從染色體中分離221

二、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增基因221

三、通過mRNA合成cDNA221

四、人工體外合成DNA片段222

第三節載體222

一、組成件223

二、載體的分類223

三、幾種常用的載體224

第四節DNA分子的體外連接229

一、全同源黏性末端的連接229

二、平頭末端連接229

三、定向克隆229

四、利用連接子連接229

五、利用適配子連接230

第五節宿主細胞230

一、原核細胞Ecoli230

二、真核細胞230

三、模式植物——擬南芥231

第六節外源基因導入宿主細胞231

第七節重組子的鋻定和外源基因的表達232

一、重組子的鋻定232

二、外源基因的表達233

第十二章外源基因表達技術

節基因表達件234

第二節外源基因在宿主細胞中的高效表達235

一、有效的轉錄起始與基因的高效表達235

二、mRNA的有效延伸和轉錄終止與基因的高效表達237

三、mRNA的穩定性與基因的高效表達237

四、有效的翻譯起始與基因的高效表達237

五、遺傳密碼應用的偏倚性與基因的高效表達239

六、mRNA的二級結構與基因的高效表達243

七、RNA的加工與基因的高效表達243

八、mRNA序列上終止密碼子的選擇243

九、表達質粒（或載體）的拷貝數及穩定性與基因的高效表達243

十、外源蛋白質的穩定性與基因的高效表達244

第三節基因的融合和融合蛋白的表達244

一、利用基因融合技術表達外源基因的優勢244

二、基因融合的策略245

三、基因融合和重組蛋白的產生246

四、基因融合和展示篩選247

五、基因融合和蛋白分泌248

六、融合蛋白的純化248

七、融合蛋白的位點特異性切割249

第四節外源基因的分泌表達249

一、外源基因在Ecoli細胞中的分泌表達250

二、外源基因在枯草杆菌中的分泌表達251

三、α-因子前導序列介導的酵母細胞分泌繫統252

四、外源基因在哺乳動物細胞中的分泌表達255

第十三章基因沉默技術

節基因沉默的機制258

一、轉錄水平上的基因沉默258

二、轉錄後的基因沉默259

第二節RNA干擾260

一、概述260

二、RNAi的可能作用機制260

三、RNAi的作用特點261

四、RNAi的研究方法262

第三節基因沉默的特點及其應用265

一、基因沉默是獲得性免疫的新途徑265

二、基因沉默的克服技術265

三、基因沉默的應用266

第十四章DNA序列測定技術

節Sanger雙脫氧鏈終止測序法270

一、Sanger雙脫氧鏈終止法的原理270

二、Sanger雙脫氧末端終止測序法技術272

三、PCR-Sanger測序法274

第二節Maxam-Gilbert DNA化學降解測序法274

第三節新一代高通量測序技術275

一、新一代測序技術簡介275

二、新一代測序技術帶來的技術變化277

三、高通量測序技術在動植物研究領域中的應用278

四、新一代高通量RNA測序數據的

處理與分析291

第十五章分子雜交技術

節分子雜交的發展及其分類301

一、分子雜交技術的發展歷程301

二、分子雜交的種類301

三、分子雜交的技術路線302

第二節探針的制備302

一、探針的種類302

二、標記物的選擇303

三、探針的放射性同位素標記306

四、探針的非放射性標記307

五、膜上印跡雜交的條件選擇307

六、雜交信號的檢測309

第三節Southern印跡310

第四節Northern印跡311

第五節Western印跡312

一、Western blot印跡方法313

二、固定化膜的種類314

三、電泳轉移314

四、封閉315

五、探針雜交315

六、顯色316

七、結果分析316

八、抗血清的制備317

第十六章生物芯片技術

節生物芯片簡介323

一、生物芯片簡介323

二、生物芯片的種類323

第二節基因芯片的基本原理和基本流程325

一、基因芯片的基本原理325

二、基因芯片的基本流程325

第三節生物芯片的應用329

一、基於芯片的序列分析329

二、基於芯片的基因功能分析332

三、基因診斷334

四、藥物篩選334

第四節生物芯片的數據處理和分析334

一、數據處理334

二、數據分析335

第十七章生物信息學技術

節生物信息學概況341

一、生物信息學的產生和發展341

二、生物信息學的研究內容341

第二節生物信息數據庫342

一、核酸數據庫343

二、蛋白質數據庫345

三、其他數據庫資源348

第三節序列比對和數據庫搜索348

一、序列兩兩比對348

二、多序列比對351

三、核酸與蛋白質結構和功能的預測分析351

第四節生物信息學的應用356

一、生物信息學在作物抗性研究中的應用356

二、生物信息學與人類基因組計劃358

參考文獻

生物化學和分子生物學是生命科學發展中重要的前沿核心學科之一，其實驗技術已成為探索生命奧秘的重要手段，在許多研究領域的應用越來越廣泛。同時，生物化學和分子生物學是生物工程、生物技術、食品科學與工程、生物制藥、動物醫學、動物科學和醫學等專業的基礎課，不僅具有較強的理論性，而且具有很強的實驗性。生物化學和分子生物學實驗是生物化學和分子生物學教學的重要組成部分，與理論教學既相互聯繫，又相對獨立，有其自身的規律、特點和要求，需要繫統地學習基礎知識，熟練地掌握實驗技術。

《生物化學與分子生物學實驗技術》以怎樣獲取生命大分子物質（包括重組蛋白）和怎麼分析研究生命大分子物質為主線，繫統地介紹生物化學與分子生物學的主要實驗原理、方法和應用。主要包括四個部分的內容：部分介紹實驗安全知識和生物大分子的制備；第二部分介紹常用的生物化學和分子生物學技術，包括光譜技術、色譜技術、膜分離技術、離心技術和電泳技術；第三部分介紹分子生物學實驗技術，主要包括核酸提取與檢測技術、文庫構建技術、基因克隆技術、基因表達和沉默技術、分子雜交技術、核酸測序技術和生物芯片技術；第四部分介紹生物信息學技術。

全書共十七章，其中章、第四章、第十四章和第十六章由阿依木古麗編寫，第七章、第十一章、第十二章、第十五章和第十七章由蔡勇編寫，第二章、第三章、第八章、第十章和第十三章由曹忻編寫，第五章由楊具田、魏玉梅和張福梅編寫，第六章由臧榮鑫、徐紅偉和李慧婧編寫，第九章由劉翊中、馮玉蘭和李耀東編寫。

本書作為西北民族大學“十二五”規劃教材，在編寫過程中得到了西北民族大學教務處、生命科學與工程學院及實驗中心等單位的領導和老師的大力支持與幫助。另外，在編寫過程中參考了大量的論文、著作和教材，引用了大量的圖表和數據，在此對相關作者表示誠摯的謝意！

本書可作為高等院校生物工程、生物技術、食品科學與工程、生物制藥、動物醫學、動物科學、發酵工程、衛生檢驗和醫學等專業的教材，也可供相關專業的學生、教師和科研工作者參考。

由於編者水平有限，書中難免存在不足之處，敬請讀者不吝指正。

編者

2015年12月

第十三章  基因沉默技術

基因沉默（gene silencing）是指生物體特定基因由於某種原因喪失表達的現像。發生沉默的基因可以是外源轉移基因，也可以是入侵病毒甚至是宿主的內源基因。研究表明，環境因子、發育因子、DNA修飾、組蛋白乙酰化程度、基因拷貝數、位置效應、生物的保護性限制修飾以及基因的過度轉錄等都與基因沉默有關。基因沉默一般有兩種情況，一種是轉錄水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），即由於DNA甲基化、異染色質化以及位置效應等引起的基因沉默。另一種是轉錄後基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），即在轉錄後通過對目標RNA進行特異性降解而使基因沉默。轉基因沉默就是外源導入並整合進受體基因組中的外源基因在當代轉化體或其後代中的表達受到抑制而不表達的現像。轉基因沉默是目前動物基因工程技術實現商業化的大障礙。

基因工程技術的內涵不僅僅是基因的轉移和獲得特異性蛋白質的表達，抑制或消除生物體基因組內某些基因的表達也是遺傳工程技術的另外一個內涵。消除或抑制基因表達的基因工程技術叫做基因沉默（gene silencing）技術。基因的沉默就是基因表達的抑制或消除。基因沉默技術就是通過構建反義基因（antisense gene）或有義基因（sense gene）來阻止蛋白質的合成。實現基因沉默有兩種方法，一種是阻止mRNA的合成，另一種就是使mRNA在到達核糖體之前失效，這兩種方法都可阻止蛋白質的合成，從而消除該基因的表達，實現基因沉默。

有義基因具有與靶細胞基因相同的編碼序列，它是由從靶細胞中獲得的mRNA通過反轉錄酶催化反轉錄而產生的。將有義基因做一些小的改變，加載到侵染體上，然後進行轉移就可以達到沉默基因的目的。目前，通過轉移有義基因來實現基因沉默的技術尚不完善。其有效性取決於有義基因在靶細胞基因組中所嵌入的位置。有義基因抑制源生基因的機理目前尚不清楚。

反義基因的核酸序列和靶細胞中內源基因的序列是互補的，反義基因可由DNA合成儀合成，加載到侵染體上後轉移到靶細胞中去。被轉移的反義基因開始轉錄mRNA，而此時所轉錄的mRNA是內源基因轉錄的mRNA的互補鏈，因此內源基因轉錄的mRNA就被混合或雜交了，雜交後的mRNA失去了正常的功能，不能指導合成原來的蛋白質，從而阻止了原性狀的表達，實現了基因沉默。

基因沉默技術在植物中首先應用在番茄上，其效能是通過基因沉默增加番茄硬度從而延長存放時間。實現這一目的的技術就是基因沉默技術。具體的原理是利用基因沉默技術消除或抑制控制番茄熟化反應的酶的基因，減少該酶的分泌，從而延長熟化過程，達到延長保存時間的目的。利用該技術已經成功培育出了存放時間較長的番茄品種。另外，利用基因沉默延緩熟化過程的技術已在其他水果和蔬菜品種的培育上廣泛使用，並取得了積極的效果。基因沉默技術還可應用於醫學領域，利用此技術可消除某些致病基因，還可關閉某些基因的表達，如致癌基因、艾滋病病毒基因、白血病基因以及其他有害基因，從而實現對遺傳性疾病和傳染病的控制以及基因治療。

節  基因沉默的機制

外源基因進入細胞核後，會受到多種因素的作用，根據其作用機制和水平的不同可將基因沉默分為轉錄水平上的基因沉默和轉錄後的基因沉默。

一、轉錄水平上的基因沉默

轉錄水平上的基因沉默是DNA水平上基因調控的結果，主要是由啟動子甲基化或導入基因異染色質化所造成的，二者都和轉基因重復序列有密切關繫。重復序列可導致自身甲基化。外源基因如果以多拷貝的形式整合到同一位點上，形成首尾相連的正向重復（direct repeat）或頭對頭、尾對尾的反向重復（inverted repeat）序列，則該基因就不能表達，而且拷貝數越多，基因沉默現像越嚴重。這種重復序列誘導的基因沉默（repeat-induced gene silencing，RIGS）與在真菌中發現的重復序列誘導的點突變（repeat-induced point mutation，RIPM）相類似，均可能是重復序列間自發配對，而甲基化酶特異性地識別這種配對結構而使其甲基化，從而抑制其表達。此外，重復序列間的相互配對還可以導致自身的異染色質化。

（一）甲基化作用機理

甲基化作用是在基因轉錄水平上進行調控的一種基本方式。宿主基因組中各個不同基因位點的甲基化程度處在一定的平衡狀態，且具有一定的空間結構特點。一旦由於外源基因的整合或病毒的侵入打破了這種平衡和空間結構特征，這種受破壞後的結構就會成為宿主基因組所識別的信號，結果使新整合進去的DNA序列發生不同程度的甲基化，進而妨礙了該基因轉錄的順利進行，從而實現基因的沉默。

（二）位置效應機理

侵入宿主的病毒基因或外源轉移基因會在基因組DNA的不同位置隨機整合。如果這些外源基因整合到宿主基因的異染色質區或進入轉錄不活躍區，則外源基因會在該區空間結構特征的影響下形成類似結構，從而導致基因的不活躍轉錄或異染色質化而失活。但如果整合位置是處於基因組轉錄活性區域，那麼外源基因也會形成類似的結構，使轉錄呈現活躍狀態，並且轉錄頻率隨其側翼DNA序列轉錄頻率的變化而發生相應的改變。

（三）正反向同源基因和多拷貝重復基因引起的TGS機理

在轉錄水平上，同源基因在同源性較高的情況下或在某些因子的影響下，可發生相互作用而使同源序列發生甲基化並失活。同樣地，多拷貝重復基因序列在整合進基因組後不論是正向還是反向都容易形成異位配對，引起基因組防御繫統的識別而被甲基化或異染色質化從而失活，其機理可能是異染色質化相關蛋白質識別重復序列間配對形成的拓撲結構並與之結合，從而將重復序列牽引到異染色質區，或直接使重復序列局部異染色質化。

（四）復雜結構外源基因引起的TGS機理

如果外源基因的組織結構比較復雜，則這種基因不容易形成規則的結構而且存在更多的酶切位點，因而在同宿主基因組DNA整合的過程中，容易引起基因的置換、重排，也容易被宿主的防御繫統所識別而遭破壞。有研究表明，通過基因槍將隻含有基因表達彈夾，包括啟動子、可讀框、終止子在內的線性DNA片段導入植物基因組，結果獲得了外源基因拷貝數大、重排頻率低、表達高效的轉基因植株。但是使用結構比較復雜的完整質粒將外源基因導入基因組後，其整合方式復雜，產生的是高拷貝數、高重排頻率的植株，轉移基因的活性以及穩定性受到嚴重影響。