了得網自然科學_納米生物檢測

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《納米生物檢測》可供有關專業人員參考閱讀，也可供高等院校的本科生和研究生閱讀參考

內容簡介

《納米生物檢測》由活躍在納米與生命分析化學交叉前沿研究領域的多位科學工作
者結合自己的研究實踐精心撰寫而成。反映了新型納米材料與探針以及納
米技術在生物檢測領域應用的*研究成果，包括對納米技術在生物檢測
中應用的一些獨到見解。《納米生物檢測》共19章，檢測方法內容涵蓋了新型納米材料
與探針的制備以及納米檢測；檢測對像涉及細胞、病原體、腫瘤以及體液樣
品等。

《納米科學與技術》叢書序
前言
第1章基於納米孔的高靈敏度生物傳感分析技術1
1.1納米孔技術簡介1
1.2蛋白米孔和態納米孔2
1.3.溶血毒素用於DNA測序4
1.4納米孔用於小分子的檢測6
1.5納米孔用於生物大分子的檢測8
1.6納米孔用於DNA中單核苷酸多態性的檢測11
1.7納米孔用於實際樣品中小分子RNA的檢測12
參考文獻15
第2章稀土熒光納米探針在生物檢測中的應用19
2.1稀土離子的性質和發光特性20
2.1.1線狀的熒光光譜21《納米科學與技術》叢書序
前言
第1章基於納米孔的高靈敏度生物傳感分析技術1
1.1納米孔技術簡介1
1.2蛋白米孔和態納米孔2
1.3.溶血毒素用於DNA測序4
1.4納米孔用於小分子的檢測6
1.5納米孔用於生物大分子的檢測8
1.6納米孔用於DNA中單核苷酸多態性的檢測11
1.7納米孔用於實際樣品中小分子RNA的檢測12
參考文獻15
第2章稀土熒光納米探針在生物檢測中的應用19
2.1稀土離子的性質和發光特性20
2.1.1線狀的熒光光譜21
2.1.2能級豐富,熒光可調21
2.1.3大的Stokes位移23
2.1.4長的熒光壽命23
2.1.5上轉換熒光24
2.2稀土熒光納米探針的設計與修飾26
2.2.1鑭繫離子-有機配體復合物納米探針26
2.2.2稀土摻雜的無機晶體熒光納米探針26
2.2.3稀土熒光納米探針的表面修飾27
2.3稀土納米撕在生命分析中的應用30
2.3.1DNA檢測30
2.3.2蛋白質檢測31
2.3.3細胞計數34
2.3.4過氧化氫檢測35
2.3.5谷胱甘肽檢測35
2.3.6pH檢測36
2.3.7葡萄糖檢測37
2.3.8氰根離子檢測37
2.3.9汞離子檢測38
2.3.10銅離子檢測39
2.4展望39
參考文獻40
第3章用於生物檢測的靜電紡絲技術45
3.1靜電紡絲的制備概述45
3.2靜電紡絲的功能調控47
3.2.1直徑48
3.2.2形貌49
3.2.3孔徑51
3.2.4材料52
3.3靜電紡絲在生化分析中的應用53
3.3.1氣體的分析檢測54
3.3.2金屬離子的分析檢測56
3.3.3生物功能分子的檢測57
3.4結論與廳61
參考文獻62
第4章基於上轉換熒光共振能量轉移的均相生物傳感68
4.1引言68
4.2熒光共振能量轉移69
4.2.1FRET的基本原理69
4.2.2能量轉移效率?的測定70
4.2.3現有FRET方法存在的主要問題70
4.3上轉換發光納米粒子71
4.3.1UCNPs的概況71
4.3.2UCNPs的發光機理71
4.3.3UCNPs材料結構73
4.3.4UCNPs的發光調控75
4.3.5UCNPs的制備方法77
4.3.6UCNPs的表面功能化78
4.4UC-FRET生物傳感80
4.4.1有機染料作能量受體81
4.4.2納米金作能量受體89
4.4.3碳納米材料作能量受體92
4.4.4其他納米材料作能量受體97
4.5結論與展望99
參考文獻100
第5章基於量子點的多色熒光檢測技術及其應用108
5.1多色熒光檢測技術的提出108
5.2多色熒光檢測技術在DNA分析中的應用109
5.3多色熒光檢測技術在蛋白質分析中的應用113
5.4雙色熒光檢測技術在病毒檢測中的應用114
5.5多色熒光檢測技術在細胞成像中的應用116
5.6微流控芯片多色量子點編碼及應用120
5.7微流控芯片多色熒光可視化檢測技術及應用123
5.8多色熒光檢測技術發展前景128
參考文獻128
第6章DNA結構介導的納米生物傳感器131
6.1線性單鏈DNA探針(一維DNA探針)131
6.1.1DNA分子在表面上的構像132
6.1.2界面上相鄰DNA探針分子之間的距離效應134
6.2二維DNA探針(具有二級結構DNA的探針)137
6.3三維DNA探針141
6.4DNA折紙芯片143
6.5DNA生物傳感器的應用147
6.5.1DNA生物傳感器用於單核苷酸多態性的檢測147
6.5.2DNA傳感器用於microRNA生物標記物的檢測150
6.5.3病原體的檢測155
6.6結論與廳156
參考文獻157
第7章用於動物重大疫病檢測的量子點生物探針164
7.1量子點生物探針用於動物重大疫病病毒檢測165
7.1.1引言165
7.1.2量子點探針的制備166
7.1.3應用量子點探針檢測動物重大疫病病毒166
7.2量子點生物探針用於動物重大疫病病原菌檢測170
7.2.1引言170
7.2.2應用量子點探針檢測動物重大疫病病原菌171
7.3量子子生物撕鮮於物重大疫疫致病機麵究175
7.3.1引言175
7.3.2量子點標記病毒的方法176
7.3.3熒光顯微鏡177
7.3.4應用量子點生物探針研究動物重大疫病致病機理177
參考文獻179
第8章利用原子力顯微和識別成像技術研究細胞膜結構183
8.1概述183
8.1.1原子力顯臟的結構和成像原理183
8.1.2原子力顯臟的成像模式183
8.1.3原子力顯臟探針的結構185
8.1.4原子力顯臟探針的功能化186
8.1.5分子識別成像顯臟的原理187
8.2AFM在液相條件下的高分辨成像188
8.2.1AFM成像基底的制備188
8.2.2AFM現場流動樣品池技術189
8.2.3AFM對核酸?染色質結構的研究190
8.2.4AFM對蛋白質成像的研究191
8.2.5分子識別成像對蛋白質糖基化的研究193
8.3AFM對細胞膜結構的釀195
8.3.1細胞膜樣品的制備197
8.3.2AFM研究紅細胞膜結構197
8.3.3紅細胞膜脂筏結構的研究204
8.3.4AFM對脂筏功能性的研究208
8.3.5AFM對線粒體膜結構的研究210
8.4小結213
參考文獻213
第9章基於核酸適配體的腫瘤細胞和活體檢測216
9.1引言216
9.2核酸適配體在細胞生命活動監測中的應用219
9.3核酸適配體用於腫瘤細胞分子分型221
9.4核酸適配體功能化的分子探針在活體分析檢測中的應用223
9.5核酸適配體功能化的納米材酬於腫瘤細胞和活體的分析檢測…226
9.5.1核酸適配體功能化金納米探針在腫瘤細胞檢測中的應用226
9.5.2核酸適配體功能化磁性納米探針在腫瘤細胞和活體分析檢測中的
應用228
9.5.3核酸適配體功能化納米熒光探針在腫瘤細胞和活體分析檢測中的
應用230
9.5.4基於核酸適配體功能化納米探針的其他檢測方法234
9.6微流控芯片技術234
9.7總結236
參考文獻236
第10章納米顆粒的組裝及在生物檢測中的應用242
10.1納米材料的自組裝242
10.1.1自組裝的概念242
10.1.2分子自且裝合成新穎的納米結構245
10.1.3以納米顆粒為的自且裝246
10.1.4電磁場誘導的納米顆粒自裝249
10.2納米材料組裝體的集體性質253
10.2.1納米材料組裝體中存在的相互作用253
10.2.2納米材料組裝體集體光學性質254
10.2.3組裝對於納米材料的集體磁學性質的影響259
10.3基於納米顆粒組裝後集體性質變化的生物檢測方法261
10.3.1利用貴重金屬納米顆粒組裝的生物檢測261
10.3.2利用磁性納米顆粒組裝的生物檢測265
10.4組裝在構建生物檢測器件中的作用266
10.5總結與展望268
參考文獻269
第11章納米探針的細胞電化學傳感273
11.1電化學傳感器273
11.2納米探針274
11.2.1納米材料簡介275
11.2.2零維納米探針275
11.2.3一維納米探針281
11.2.4二維納米探針285
11.3細胞固定及仿生界面的構建288
11.4腫瘤細胞檢測289
11.4.1納米電化學阻抗傳感289
11.4.2靶向細胞檢測290
11.4.3基於適配體的納米細胞電化學傳感291
11.4.4基於細胞表面麵的納米細胞電化學傳感293
11.5基於納米探針的細胞凋亡電化學傳感器294
11.5.1細胞凋亡簡介294
11.5.2細胞凋亡的檢測技術295
11.5.3細胞凋亡的電化學檢測297
參考文獻302
第12章細胞光散射成像分析311
12.1引言311
12.2細胞光散射成像的特點311
12.2.1光散射成像及顯微光譜技術311
12.2.2光散射納米探針313
12.2.3細胞光散射成像的影響因素314
12.3細胞實時光散射成像及傳感分析314
12.3.1活細胞標記?成像和示蹤315
12.3.2活細胞內生物分子傳感及實時監測321
12.4納米標記對細胞光散射成像分析的影響325
12.4.1光散射納米探針的細胞生物相容性325
12.4.2光散射納米探針對細胞?組織和胚胎的影響326
12.4.3光散射納米探針應用於細胞成像分析面臨的主要挑戰327
12.5存在的問題及未來發展方向327
12.5.1存在的問題及其可能的解決方案327
12.5.2未來潛在的發展方向328
參考文獻328
第13章拉曼光譜與增強拉曼光譜在細胞檢測中的應用333
13.1拉曼光譜和增強拉曼光譜的基本原理334
13.1.1光的散射334
13.1.2拉曼光譜335
13.1.3共振拉曼光譜336
13.1.4表面增強拉曼光譜336
13.2SERS細胞體繫細中基本方法學340
13.2.1直接檢測340
13.2.2間接檢測343
13.2.3數據分析346
13.3拉曼光譜和增強拉曼光譜的儀器技術發展347
13.3.1拉曼光譜及其聯用技術347
13.3.2成像技術350
13.4SERS和拉曼光譜在細胞體繫的應用352
13.4.1細胞分類與檢測352
13.4.2細胞內微環境的檢測355
13.4.3細胞生命過程監測357
13.4.4納米材料在細胞內的監測362
13.5現存問題及展望367
參考文獻370
第14章用於細胞實時探測的納米電化學探針技術376
14.1概述376
14.2納米電極優良的電化學特性376
14.3納米電極的制備377
14.3.1納米帶電極377
14.3.2納米盤電極378
14.3.3納米錐電極380
14.3.4碳納米管電極382
14.3.5納米孔電極382
14.3.6納米電極陣列384
14.4納米電化學傳感器實時探測細胞信號分子387
14.4.1納米電化學探針高時空分辨監測信號分子釋放387
14.4.2突觸間隙內部探測388
14.4.3細胞內部實時探測389
14.4.4基於掃描電化學顯臟探針的細胞實時監測389
14.5納米電極陣列用於細胞實時探測393
14.5.1納米電極陣列實時監測細胞胞吐與電生理研究394
14.5.2納米線場效應晶體管陣列用於細胞電生理研究395
14.6總結與展望397
參考文獻397
第15章面向腫瘤研究的量子點標記生物探針402
15.1引言402
15.2量子點的性質及其水溶性化修飾403
15.2.1量子點的熒光性質403
15.2.2量子點的合成與表面化學性質406
15.2.3量子點水溶性化修飾407
15.3生物探針構建中常用的及標記策略412
15.3.1氨基酸?多肽和蛋白質的性質及其標記策略412
15.3.2核酸的性質及其標記策略414
15.4基於量子點標記的生物探針構建策略415
15.5基於量子點標記的生物探針在腫瘤研究中的應用418
15.5.1基於量子點標記的生物探針在腫瘤檢測中的應用418
15.5.2基於量子點標記的生物探針在腫瘤轉移相關研究中的應用423
15.5.3基於量子點標記的生物探針在腫瘤異質性研究中的應用425
15.5.4基於量子點標記的生物探針在腫瘤研究中的機遇和挑戰427
參考文獻428
第16章腫瘤磁共振診斷用磁性納米材料的研究進展434
16.1磁性納米造影劑的原理434
16.1.1磁性納米材料的磁學性質434
16.1.2MRI的基本原理436
16.1.3磁性納米材料造影劑的信號增強原理437
16.2腫瘤磁共振納米造影劑的發展及應用分類438
16.2.1腫瘤磁共振臨床診斷的現狀與發展趨勢438
16.2.2腫瘤磁共振納米造影劑的應用分類439
16.3腫瘤磁共振納米造影劑的制備及應用440
16.3.1超順磁性納米造影劑440
16.3.2順磁性納米材料造影劑455
16.4總結與展望459
參考文獻460
第17章納米技術基礎上的胃癌預警與早期診斷繫統467
17.1目

在線試讀

第1章基於納米孔的高靈敏度生物傳感分析技術
1.1納米孔技術簡介
納米孔傳感技術是20世紀90年代中期開始發展起來的新興分析手段。納米孔，顧名思義，指的是孔徑尺寸在納米尺度的孔道，通常為1?100nm。生物體內的水通道、離子通道等均屬於納米孔。目前，基於納米孔的傳感器主要分為兩類:，生物源的蛋白納米孔家族[圖1-1(a)?(c)]，包括金黃色葡萄球菌a-溶血毒素(a-hemolysin)[1]，恥垢分枝杆菌毒素蛋白A(MspA)[2]，以及噬菌體phi29連接器馬達蛋白（phi29connector)^等;第二，以人工材料制備的固態納米孔[圖1-1(d)、(e)]，不論是無機的硅、氮化硅、石墨烯，還是有機的高分子薄膜均可制備納米孔[4-7]。近兩年，一些蛋白孔和固態孔相結合形成的新型復合孔結構也開始陸續被報道[圖1-1(f)][8]。一般來說，納米孔並不能獨立存在，蛋白納米孔需要磷脂雙分子層支持，而固態納米孔往往是以硅作為基底。
納米孔傳感器主要基於電流信號進行檢測（圖H在外加電場作用下，溶液中的電解質離子定向遷移並穿過納米孔從而產生電流，該電流信號經膜片鉗繫統檢測、放大和轉換而被記錄。當溶液中存在待檢測物質時，該物質經擴散或電壓驅動穿越納米孔並與之相互作用，此時孔道內通過的離子數目由於待測物的占據發生變化，從而導致記錄到的電流產生改變，此稱為一個事件（event)。通過對大量穿越事件的統計分析，便可對該未知待測物進行定性和定量判斷:其中電流的振幅和阻滯時間與物質種類和結構相關，而事件的頻率則反映待測物在溶液中的濃度，二者通常情況下成正比[9]。
1.2蛋白納米孔和固態納米孔
目前，蛋白納米孔中研究多的是a-溶血毒素。a-溶血毒素單體由金黃色葡萄球菌分泌，鮮體能與細胞膜結合並聚合形成七聚體跨膜通道，從而弓丨起細胞內外滲透壓失衡，細胞去極化和營養物質流失，進而導致細胞死亡。a-溶血毒素外觀呈蘑菇狀[1]，由膜外冠狀區域（cap)和跨膜桶狀區域(a-barrel)組成。從內部結構看，冠狀區域內包含一個空腔(vestibule)，而跨膜部分則是直徑為2.6nm的通道，二者連接處為一個！@nm大小的狹窄區域(constrictionsite)，該區域經常作為識別位點直接或間接參與到檢測中。自從1996年美國標準技術研究所的Ka-sianowicz，加州大學聖塔巴巴拉分校的06326?和哈佛大學的等首次報道單鏈DNA和RNA分子可穿越a-溶血毒素納米通道[10]以來，各種基於蛋白納米孔的DNA測序、單分子化學以及生化檢測等研究便蓬勃發展起來。其中，牛津大學Bayley教授領導的團隊在蛋白定點突變方面做出了非常卓越的工作,大大豐富了蛋白納米孔檢測的手段。2012年年初，Bayley所雛的牛津納米孔技術公司(OxfordNanoporeTechnologies)成功開發出第三代納米孔測序技術，在業界引起巨大轟動。第1章基於納米孔的高靈敏度生物傳感分析技術
1.1納米孔技術簡介
納米孔傳感技術是20世紀90年代中期開始發展起來的新興分析手段。納米孔，顧名思義，指的是孔徑尺寸在納米尺度的孔道，通常為1?100nm。生物體內的水通道、離子通道等均屬於納米孔。目前，基於納米孔的傳感器主要分為兩類:，生物源的蛋白納米孔家族[圖1-1(a)?(c)]，包括金黃色葡萄球菌a-溶血毒素(a-hemolysin)[1]，恥垢分枝杆菌毒素蛋白A(MspA)[2]，以及噬菌體phi29連接器馬達蛋白（phi29connector)^等;第二，以人工材料制備的固態納米孔[圖1-1(d)、(e)]，不論是無機的硅、氮化硅、石墨烯，還是有機的高分子薄膜均可制備納米孔[4-7]。近兩年，一些蛋白孔和固態孔相結合形成的新型復合孔結構也開始陸續被報道[圖1-1(f)][8]。一般來說，納米孔並不能獨立存在，蛋白納米孔需要磷脂雙分子層支持，而固態納米孔往往是以硅作為基底。
納米孔傳感器主要基於電流信號進行檢測（圖H在外加電場作用下，溶液中的電解質離子定向遷移並穿過納米孔從而產生電流，該電流信號經膜片鉗繫統檢測、放大和轉換而被記錄。當溶液中存在待檢測物質時，該物質經擴散或電壓驅動穿越納米孔並與之相互作用，此時孔道內通過的離子數目由於待測物的占據發生變化，從而導致記錄到的電流產生改變，此稱為一個事件（event)。通過對大量穿越事件的統計分析，便可對該未知待測物進行定性和定量判斷:其中電流的振幅和阻滯時間與物質種類和結構相關，而事件的頻率則反映待測物在溶液中的濃度，二者通常情況下成正比[9]。
1.2蛋白納米孔和固態納米孔
目前，蛋白納米孔中研究多的是a-溶血毒素。a-溶血毒素單體由金黃色葡萄球菌分泌，鮮體能與細胞膜結合並聚合形成七聚體跨膜通道，從而弓丨起細胞內外滲透壓失衡，細胞去極化和營養物質流失，進而導致細胞死亡。a-溶血毒素外觀呈蘑菇狀[1]，由膜外冠狀區域（cap)和跨膜桶狀區域(a-barrel)組成。從內部結構看，冠狀區域內包含一個空腔(vestibule)，而跨膜部分則是直徑為2.6nm的通道，二者連接處為一個！@nm大小的狹窄區域(constrictionsite)，該區域經常作為識別位點直接或間接參與到檢測中。自從1996年美國標準技術研究所的Ka-sianowicz，加州大學聖塔巴巴拉分校的06326?和哈佛大學的等首次報道單鏈DNA和RNA分子可穿越a-溶血毒素納米通道[10]以來，各種基於蛋白納米孔的DNA測序、單分子化學以及生化檢測等研究便蓬勃發展起來。其中，牛津大學Bayley教授領導的團隊在蛋白定點突變方面做出了非常卓越的工作,大大豐富了蛋白納米孔檢測的手段。2012年年初，Bayley所雛的牛津納米孔技術公司(OxfordNanoporeTechnologies)成功開發出第三代納米孔測序技術，在業界引起巨大轟動。
與蛋白納米孔經由生物表達獲得不同，固態納米孔主要是通過聚焦的高能電子束或離子束直接擊穿薄膜材料或電子束轟擊與異相刻蝕相結合來制備。相較而言，離子束能量比電子束更大，在尺寸控制和材料選擇上都更黯優勢。到目前為止，已成功制備固態納米孔的材料包括:氮化硅、二氧化硅、碳化硅、氧化鋁、石墨烯、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚酰亞胺(PI)，而材料厚度通常在幾納米至幾百納米不等。固態納米孔制備過程中需要用到離子檢測器來反饋監測孔的制備進程，以便控制孔徑大小。2001年，哈佛大學的Golovchenko等利用氬離子濺射法，首次成功得到氮化硅納米孔，其尺寸為1.8nm[4]。2010年，該課題組和其他兩個研究團隊又分麵過電子束轟擊得到僅有單原子厚度的石墨烯納米孔[7,11，12]，為DNA測序提供了新的方向。
雖然蛋白納米孔和固態納米孔均是納米級的孔道,在基本工作原理上也一致，但兩者在制備重復性、孔徑大小、穩定性、修飾方法等多個方面還是有著顯著的不同。
⑴制備重復性。蛋白孔的結構在空間上是精確到原子的，因此保證了每次制備的納米孔孔徑完全一致，也確保了實驗的可重復性。而固態納米孔主要是通過電子束或離子束轟擊結合化學刻蝕相來制備，盡管配備有反饋裝置進行實時控制，但無法保證敏翻孔徑和開形完全相同的孔。
⑵孔徑大小。通常來說，通道蛋白的尺寸不會超過10nm。例如，MspA窄處為1nm，phi29馬麵白則為3.6nm。固態孔貝則同，可根據實驗需要自由調節實驗錄，如離子束強度、轟擊時間、刻蝕時間等，使得制備的孔徑從幾納米到幾
十納米不等。二者孔徑的差異決定了檢測策略不同。
(3)穩定性。蛋白納米孔的基底一般為磷脂雙分子層，對機械振動比較敏感，無法進行轉移。而納米孔本身也對溶液pH、溫度、化學環境等因素有一定要求。例如，a-溶血毒素雖然已經是一種耐受性很高的蛋白，但其在pH條件下和高於5mol/L的尿素溶液中也會變性分解。相較而言，固態納米孔則穩定得多，適用於各種環境,釀可重復使用。
⑷修飾方法。蛋白納米孔的優勢在於已知單晶結構時經過基因突變可在任意位點修飾任意氨基酸殘基，而固態納米孔則更適合於利用各種化學反應進行表面修飾。
綜上所述，固態納米孔和蛋白納米孔互有優缺點，各自有適用的對像和領域，同時相互補充。
1.3 a-溶血毒素用於DNA測序
納米孔測序的歷史可以追溯到1996年Branton與Deam?等用a-溶血毒素蛋白次觀察到單個DNA分子在納米孔中的穿越行為[10]，並提出了納米孔測序的概念:單鏈DNA中的依次通過納米孔，然後根據監測到的電流信號變化而獲得完整的序列信息。與傳統測序方法相比,納米孔測序具備許多優點:無須標記、無須擴增、高通量檢測、可直接對長鏈DNA測序。雖然擁有誘人的前景，但納米孔測序一直面臨著兩個關鍵的問題:DNA穿越納米孔速度過快;空間分辨率無法達到識別單個堿基。
a-溶血毒素是納米孔測序中研究早也是成果多的納米孔。早期，研究者在減緩DNA穿越速度方面做了很多工作，包括降低溫度[13，14]、增大溶液黏度[15]、加入有機鹽[16]、增強DNA/納米孔相互作用[17]等，但效果都比較有限。真正可能有實用性的方法由Gundlach課題組[18]和Akeson課題組[19]在2012年年初提出，他們利用一種phi29聚合酶來達到控制DNA緩慢穿越的目的。Phi29聚合酶首先同目標DNA模板與引物形成的雙鏈結構結合，並在DNA的引導作用下停留在a-溶血毒素或恥垢分枝杆菌毒素蛋白A上方。然後聚合酶開始復制反應，隨著引物鏈的不斷延伸，目標DNA分子便在納米孔逐步移動，復制反應的速度便決定了DNA穿越納米孔的快慢[圖1-3(a)?（d)]。通過此方法，單個堿基的通過速度被控制在25?400ms，較之前有了至少3~4個數量級的提升;且電流信號的變化可以達到分辨單個堿基的精度。
a-溶血毒素對堿基識別的空間分辨率不高，因為整個跨膜區域中的DNA片段(包含約15個核苷酸)都對電流信號有貢獻。Bayley組通過將DNA固定在納米孔中，發現了P跨膜區域中對DNA堿基敏感的三個位點[20]。經過基因突變優化，a-溶血毒素可區分A、T、G、C四種正常堿基和甲基胞嘧啶與羥甲基胞嘧啶兩種修飾堿基，但僅限於特定位點的識別[21]。
同經典的整鏈DNA測序理念不同，Bayley組在2009年又提出了外切核酸酶輔助的單分子DNA測序概念，BP將外切核酸酶以合適的構像固定在a-溶血毒素孔口，切下的核苷酸按順序逐個通過納米孔被檢測，從而達到測序目的[23](圖1-4)。雖然文中報道稱四種堿基的識別準確率可達99.8%，但該方法仍需要解決兩個問題:①以何種方式固定外切核酸酶，以保證酶的活性;②保證切下的每個堿基都能依次進入納米孔。
2012年2月，Bayley創立的牛津納米孔技術公司宣布其成功開發出了商業化的納米孔測序儀，這標志著納米孔測序技術掀開了一個新的篇章[4]。1.4納米孔用於小分子的檢測
在蛋白納米孔的研中，超過90%的成果都來自於a-溶血毒素蛋白。a-溶血毒素檢測的對像非常多樣化，既可為有機小分子，也可為無機離子。1999年，Bayley實驗組首次報道a-溶血毒素納米孔可用於溶液中有機金剛烷小分子的檢測[25][圖1-5(a)、(b)]。他們在體繫中加入稱為“適配器”的#環糊精，由於#環糊精與溶血毒素的孔徑恰好匹配，其可在納米孔內停留長達數十毫秒，從而為監測金剛烷分子與環糊精的相互作用提供足夠的時間。但是，野生型a-溶血毒素蛋白有一個缺點，適配器#環糊精在孔道內的停留時間有限，通常為幾百微秒至幾十毫秒，無法對強相互作用的分子進行研。Bayley組經過蛋白定點突變研究發現，蛋白通道靠近狹窄區域的113位點的氨基酸殘基對#環糊精的停留時間有著關鍵性影響，其中某些突變體能夠穩定#環糊精達數十秒[26，27]。在此改進基礎上，Kang及其同事實現了同分異構藥物分子布洛芬和沙利度胺在納米孔中的手性區分，同時研究了人血清白蛋白（HSA)

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