第1章CRISPR-Cas繫統概述 001

1.1引言 002

1.2CRISPR-Cas分類 003

1.32類CRISPR-Cas繫統 004

1.4CRISPR-Cas繫統的遞送方法 005

1.5CRISPR-Cas繫統的非基因組編輯方法 005

1.5.1用CRISPR-Cas13和rCas9靶向RNA 005

1.5.2CRISPRa/CRISPRi、表觀遺傳修飾和標記 006

1.6CRISPR-Cas商業化現狀 007

1.7結語 007

參考文獻 008



第2章基因編輯技術史話 011

2.1引言 012

2.2基因編輯技術的歷史先河：基因打靶技術 012

2.3曇花一現：鋅指核酸酶技術和類轉錄激活因子效應物核酸酶技術 015

2.4革命時代的來臨：CRISPR技術 018

2.5結語 021

參考文獻 022



第3章基於CRISPR-Cas繫統的基因編輯技術的進展 025

3.1引言 026

3.2基因編輯技術的發展 026

3.3CRISPR-Cas繫統的多樣性、分類與演變 028

3.3.1CRISPR-Cas繫統分類及作用原理 028

3.3.2CRISPR-Cas繫統的源起和進化 029

3.4CRISPR-Cas繫統的應用進展 031

3.4.1在細菌及古菌中的應用 031

3.4.2在真菌中的應用 032

3.4.3在植物細胞中的應用 033

3.4.4在動物細胞中的應用 034

3.5CRISPR-Cas繫統的前瞻性應用 035

3.6結語 037

參考文獻 037



第4章CRISPR-Cas9的結構和作用機制 043

4.1引言 044

4.2CRISPR-Cas9生物學 044

4.3Cas9酶 046

4.3.1Apo酶的雙葉結構 046

4.3.2HNH和RuvC核酸酶結構域 047

4.4CRISPR-Cas9效應復合物的組裝 047

4.4.1sgRNA結合後的構像重排 048

4.4.2Cas9與sgRNA的相互作用 048

4.4.3預排序種子RNA以及Cas9與PAM的相互作用 049

4.5目標搜索與識別 049

4.5.1RNA-DNA異源雙鏈 050

4.5.2PAM識別 051

4.5.3局部DNA熔解和R環形成 051

4.5.4Cas9誘導的DNA彎曲 053

4.6靶標切割 053

4.6.1解偶聯的DNA結合和切割事件 054

4.6.2通過HNH-RuvC通訊進行DNA協同切割 054

4.6.3非靶DNA鏈在HNH重定位中的關鍵作用 055

4.7CRISPR-Cas9介導的DNA靶向和切割模型 056

4.8Cas9直繫同源物的結構 056

4.9結語 057

參考文獻 058



第5章CRISPR介導的表觀遺傳學編輯 063

5.1引言 064

5.2針對組蛋白的表觀修飾 065

5.2.1轉錄激活 065

5.2.2轉錄抑制 066

5.2.3目前的局限性 067

5.2.4克服當前局限性 069

5.3針對DNA的表觀修飾研究 070

5.3.1DNA甲基化 070

5.3.2DNA去甲基化 071

5.3.3使用CRISPR介導的方法探測新的DNA表觀遺傳修飾 072

5.3.4m5dC衍生物的氧化 072

5.3.5N6-甲基脫氧腺苷的發現 072

5.3.6發現新的DNA表觀遺傳修飾 073

5.4針對非編碼RNA的表觀遺傳學功能 074

5.5化學和光誘導基因組表觀編輯 075

5.6表觀基因組編輯與病理和醫療 076

5.7超越CRISPR-Cas9 077

5.8結語 078

參考文獻 080



第6章CRISPR-Cas9的脫靶效應 089

6.1引言 090

6.2小化CRISPR-Cas9繫統脫靶效應的策略 091

6.2.1改善sgRNA-Cas9復合物的有效濃度和sgRNA-Cas9復合物遞送 091

6.2.2sgRNA分子的合理設計 093

6.2.3新的Cas9變體的合理工程設計 094

6.2.4Cas9直繫同源物 095

6.2.5Ⅱ類Cas9直繫同源物 096

6.3CRISPR-Cas9繫統中脫靶效應的檢測方法 098

6.3.1預測的脫靶位點檢測 099

6.3.2WGS 099

6.3.3ChIP-seq 099

6.3.4IDLV捕獲 100

6.3.5BLESS 100

6.3.6GUIDE-seq 101

6.3.7LAM-HTGTS 101

6.3.8Digenome-seq 102

6.3.9SITE-seq 102

6.3.10CIRCLE-seq 103

6.3.11GOTI 103

6.3.12PEM-seq 104

6.3.13DISCOVER-seq 104

6.4結語 105

參考文獻 105



第7章CRISPR-Cas9的實驗模型 112

7.1引言 113

7.2細胞模型 114

7.3動物模型 118

7.3.1鼠 118

7.3.2果蠅 120

7.3.3斑馬魚 121

7.3.4豬 123

7.3.5其他動物模型 123

7.4植物 125

7.5真菌 127

7.6細菌 129

7.7結語 133

參考文獻 133



第8章納米材料遞送CRISPR-Cas繫統 136

8.1引言 137

8.2納米材料概述 137

8.2.1納米材料定義及特性 137

8.2.2納米材料的分類 138

8.2.3納米材料的應用 138

8.3基因療法簡介 139

8.4納米材料遞載CRISPR-Cas繫統的生物應用 140

8.4.1二維納米材料遞送CRISPR-Cas繫統的生物應用 140

8.4.2貴金屬及自組裝納米材料遞載CRISPR-Cas繫統的生物應用 143

8.4.3其他納米材料遞載CRISPR-Cas繫統的生物應用 145

8.5結語 146

參考文獻 147



第9章全基因組CRISPR-Cas9基因敲除和轉錄激活篩選的實驗方案 149

9.1引言 150

9.2實驗設計 151

9.2.1篩選方法 151

9.2.2sgRNA文庫的設計和選擇 151

9.2.3構建和遞送sgRNA文庫的方法 152

9.2.4選擇sgRNA 153

9.3材料 155

9.3.1試劑 155

9.3.2耗材及設備 160

9.3.3試劑制備 162

9.3.4材料準備 164

9.3.5步驟 164

9.4結語 189

參考文獻 189



第10章細菌中的CRISPR-Cas繫統及其功能 191

10.1引言 192

10.2細菌中CRISPR的分布 193

10.3CRISPR-Cas繫統在細菌研究中的應用 194

10.3.1對細菌基因組進行編輯 194

10.3.2參與細菌基因的表達調控 195

10.3.3與細菌生物膜、毒力和細菌耐藥的關繫 196

10.3.4參與細菌與宿主的相互作用 196

10.3.5與細菌分型的關繫 197

10.3.6基於CRISPR繫統的細菌進化分析 198

10.3.7與核酸檢測的關繫 198

10.4CRISPR-Cas繫統的應用可能帶來的倫理問題及有害影響 200

10.5結語 201

參考文獻 201



第11章CRISPR-Cas技術在抵抗病原微生物感染中的應用 206

11.1引言 207

11.2CRISPR-Cas9基因編輯繫統在病毒相關疾病治療中的應用 207

11.3CRISPR-Cas9基因編輯繫統在細菌和真菌中的應用 208

11.4結語 209

參考文獻 209



第12章CRISPR-Cas9在免疫學研究中的應用 211

12.1引言 212

12.2CRISPR-Cas9在免疫相關疾病發病機制研究中的應用 212

12.2.1造血繫統惡性腫瘤疾病機制及動物模型研究 212

12.2.2CRISPR-Cas9全基因組篩選用於研究復雜生命過程 213

12.3CRISPR-Cas9在免疫相關疾病治療中的應用 214

12.3.1腫瘤免疫治療 214

12.3.2治療HIV感染 215

12.4結語 217

參考文獻 218



第13章CRISPR-Cas繫統在核酸檢測中的應用 220

13.1引言 221

13.2基於CRISPR-Cas繫統的核酸檢測分類 222

13.2.1基於Cas9繫統的核酸檢測 222

13.2.2基於CRISPR-Cas12和Cas14繫統的DNA檢測 223

13.2.3基於CRISPR-Cas13繫統的RNA檢測 225

13.3CRISPR-Cas核酸檢測繫統的優勢及局限性 227

13.4結語 227

參考文獻 228



第14章CRISPR-Cas9在疾病治療中的應用 229

14.1引言 230

14.2CRISPR-Cas9繫統在癌癥生物學中的潛在應用 230

14.3CRISPR-Cas9在遺傳性疾病中的作用 231

14.4CRISPR-Cas9在病毒性疾病中的作用 232

14.5CRISPR-Cas9在神經繫統疾病中的作用 234

14.6CRISPR-Cas9在過敏和免疫疾病中的作用 234

14.7結語 235

參考文獻 236



第15章CRISPR-Cas在傳染病檢測和治療中的應用 237

15.1引言 238

15.2CRISPR-Cas生物學 238

15.2.1獲取間隔序列 239

15.2.2crRNA生成 239

15.2.3干擾 240

15.3CRISPR-Cas9技術概述 242

15.3.1CRISPR-Cas9基因工程 242

15.3.2sgRNA文庫用於篩選基因型-表型 242

15.3.3使用失活的Cas9調節基因轉錄 242

15.4在傳染病中的應用 243

15.4.1了解宿主與病原體的相互作用 243

15.4.2在傳染病診斷中的應用 244

15.4.3CRISPR-Cas在治療中的應用 246

15.5結語 249

參考文獻 251

CRISPR-Cas這項技術自問世以來，已經無數次吸引了人們的目光，在短短幾年之內，它已經成為生物科學領域炙手可熱的研究工具，並有上千篇相關文獻發表。CRISPR-Cas技術的先驅者們，包括珍妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）和艾曼紐·夏邦傑（Emmanuelle Charpentier）兩位美女科學家以及華裔科學家張鋒，在該領域做出了重要貢獻。這裡當然還包括提高了Cas9的特異性並發明了CRISPR-Cas堿基編輯技術的科學家大衛·劉（David R.Liu），他的實驗室培養出了許多國內CRISPR-Cas領域的精英。

為了使廣大科研工作者尤其是許多沒有經驗但感興趣的人更好地了解CRISPR-Cas技術，在化學工業出版社編輯的提議下，經過編者們一年多的辛苦寫作和出版者的審校工作，本書成功出版了！全書共15章，繫統介紹了CRISPR-Cas技術的發展史、研究進展、結構組成、表觀編輯、脫靶效應、脫靶檢測方法、實驗方案、實驗模型和遞送繫統，以及在微生物學、免疫學、疾病治療和傳染病核酸檢測中的應用。

CRISPR-Cas繫統，其中CRISPR全稱是clustered regularly interspaced short palindromic repeats（簇狀規則間隔短回文重復序列），而Cas的全稱是CRISPR associated proteins（CRISPR相關蛋白）。CRISPR-Cas繫統廣泛存在於古菌與細菌中，是原核生物的一種獲得性免疫繫統（類似於哺乳動物的適應性免疫），通過識別並降解再次入侵的核酸，實現抵抗外來遺傳物質（如噬菌體）的入侵。同時，CRISPR-Cas繫統由於其精確的靶向功能。已被開發成一種高效的CRISPR-Cas基因編輯工具。在CRISPR-Cas繫統中，研究深入、應用成熟的是CRISPR-Cas9繫統。CRISPR-Cas9是繼鋅指核酸酶（ZFN）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）之後出現的第三代基因組定點編輯技術。

在此感謝各位編者辛勤的付出，是你們在本領域的豐富知識和寶貴經驗使得這本書更具閱讀價值。本書難免有不妥之處，敬請廣大讀者批評指正！



劉世利

2020年7月