總前言
第一篇組織顯微結構與細胞超微結構研究方法
第一章組織顯微結構研究的光鏡實驗方法
第一節組織學和病理學常規實驗方法
第二節光鏡組織化學與特殊染色
第三節光鏡酶組織化學
第四節光鏡免疫組織化學
第五節光鏡原位雜交組織化學
第六節原位凋亡檢測技術（TUNEL法）
第七節光鏡顯微鏡圖像定量分析
第二章細胞超微結構研究的電鏡實驗方法
第一節概述
第二節透射電鏡常規樣品制備
第三節示蹤與離子電鏡細胞化學
第四節電鏡特殊染色
第五節電鏡免疫細胞化學
第六節細胞器標志酶電鏡細胞化學
第七節透射電鏡、掃描電鏡與超微結構圖像定量分析
第三章細胞超微結構與組織顯微結構的觀察
第一節概述
第二節細胞超微結構與常見變化
第三節幾類細胞的超微結構
第四節組織顯微結構與常見病變
第四章常見器官的組織顯微結構與細胞超微結構及病變
第一節消化器官的顯微結構與超微結構及病變
第二節運動器官的顯微結構與超微結構及病變
第三節心血管的顯微結構與超微結構及病變
第四節內分泌器官和組織的顯微結構與超微結構及病變
第五節神經繫統的顯微結構與超微結構及病變
第六節泌尿器官的顯微結構與超微結構及病變
第七節免疫器官的顯微結構與超微結構及病變
第八節呼吸器官的顯微結構與超微結構及病變
第九節血細胞的顯微結構與超微結構及病變
第五章組織和細胞立體結構與成分研究的激光掃描共聚焦顯微術
第一節概述
第二節熒光探針的選擇和熒光標記樣品的制備
第三節組織和細胞結構與成分觀察實驗
第四節細胞器三維結構觀察實驗
第五節細胞生理功能動態觀察實驗
第六節激光掃描共聚焦顯微鏡
第二篇細胞生物學實驗研究方法
第六章細胞培養與分析
第一節細胞培養的基本原理與技術
第二節細胞培養的方法
第三節細胞的凍存、復蘇與運輸
第四節體外培養細胞的觀察
第五節細胞增殖、凋亡分析
第七章免疫細胞的分離與分析
第一節概述
第二節免疫細胞的分離制備
第三節免疫細胞的功能分析
第八章血液流變學研究技術
第一節概述
第二節血液黏度檢測
第三節血小板聚集、黏附功能檢測
第九章流式細胞術
第一節概述
第二節單細胞懸液的樣本制備
第三節流式細胞術的標記方法、結果分析與意義
第四節流式細胞術在醫學科學研究中的應用
第五節流式細胞儀結構和原理
第三篇生化與分子生物學實驗研究方法
第十章核酸提取分析
第一節概述
第二節DNA提取
第三節RNA提取
第四節核酸分析
第五節核酸電泳
第十一章分子雜交
第一節概述
第二節Southern印跡雜交
第三節Northern印跡雜交
第四節Western印跡雜交
第十二章聚合酶鏈反應（PCR）
第一節概述
第二節PCR技術基本操作
第三節RT—PCR
第四節PCR引物設計
第十三章分子克隆
第一節概述
第二節目的DNA片段的獲取
第三節目的DNA片段的處理、純化及鋻定
第四節載體的選擇與處理
第五節載體與目的基因片段的連接
第六節重組質粒轉化感受態大腸埃希菌
第七節重組克隆子的篩選與鋻定
第十四章蛋白表達
第一節概述
第二節外源基因在大腸埃希菌中的誘導表達
第三節外源基因在真核細胞中的表達（細胞轉染）
第十五章蛋白質的提取和分析
第一節概述
第二節蛋白的分離提取、純化
第三節總蛋白含量測定
第四節酶聯免疫分析
第五節放射免疫分析
第六節蛋白電泳
第十六章常規生物化學實驗技術
第一節概述
第二節糖類實驗分析
第三節酶類實驗分析
第四節脂類實驗分析
第四篇中藥與天然藥物化學及其活性研究方法
第十七章中藥與天然藥物化學成分的一般研究方法
第一節中藥與天然藥物化學成分提取
第二節中藥與天然藥物化學成分分離
第三節中藥與天然藥物化學成分的研究各論
第十八章中藥與天然藥物化學成分指紋圖譜研究方法
第一節構建中藥與天然藥物化學成分指紋圖譜的技術要求
第二節應用HPLC構建草珊瑚化學成分指紋圖譜的研究實例
第十九章中藥與天然藥物活性物質篩選方法
第一節生物活性導向分離法篩選中藥與天然藥物活性物質
第二節計算機模擬技術篩選中藥與天然藥物活性物質
第三節中藥與天然藥物化學成分的生物活性測試法
第四節中藥復方藥效物質基礎研究方法
彩圖

第一篇組織顯微結構
與細胞超微結構研究方法
第一節組織學和病理學常規實驗方法
一、概述
組織學和病理學實驗方法在醫學科學領域裡占有重要地位，是醫學教學和科研中不可缺少的一
個組成部分。組織制片標本可以顯示各種組織細胞的基本結構和形態，而制片的質量將直接影響科
研教學觀察和臨床病理診斷。
最早應用的組織制片技術是冰凍切片，但冰凍切片顯示的組織清晰度相對較差，目前通常用於
術中快速診斷，或者用於顯示組織中的脂類物質、某些酶等。隨著冰凍切片的應用和實踐，人們進一
步利用石蠟的硬度，將要檢查的組織塊浸漬並包埋於這種堅硬的介質之中，制成了石蠟切片，石蠟切
片不僅清晰度高，而且易於保存，可用於大部分的染色和檢驗，是目前最常用的制片方法。後來又利
用明膠、火棉膠等物質的韌性來包埋組織，制成了明膠切片和火棉膠切片，用於較大、較堅硬、比較脆
弱的組織和易於塌陷的器官等的制作；用塑料包埋或樹脂包埋制作不脫鈣的骨組織切片等。目前石
蠟切片制作法仍是組織病理學的常規實驗方法。
二、用途、原理、特點
1.主要用途
石蠟切片可通過常規染色在光鏡下觀察其一般的顯微結構，亦可通過特殊染色技術、免疫組織
化學技術以及原位雜交等技術觀察組織的特定結構成分。
2.實驗原理
將細胞和組織進行固定，使其保存原有的形態和固有物質；通過包埋劑滲透凝固後制作成有一
定硬度的石蠟包埋塊，再切成幾微米厚的切片，經染色劑染色後可在光鏡下觀察其顯微結構。
3.特點
常規石蠟切片清晰度高，易於保存，可用於大部分組織的染色和檢驗。
三、實驗操作（石蠟切片法）
（一）簡要步驟
簡要步驟如下：①取材；②固定；③脫水；④透明；⑤浸蠟；⑥包埋；⑦切片；⑧染色；⑨封固。
（二）具體步驟
1.取材
（1）主要實驗儀器/器材/重要試劑
1）儀器或器材：剪刀、鑷子、單面刀片或雙面刀片、標本瓶、標簽等。
2）試劑：麻醉劑、生理鹽水等。
（2）實驗操作
1）預先準備好固定液（見固定章節），分裝在標本瓶內，貼好標簽。
2）動物組織取材：將動物麻醉或處死，暴露所需的器官；用鋒利的刀片切下所需器官或組織，進
行初步修切後，盡快投入固定液。
3）細胞取材：①塗片法。血液等可直接均勻塗在載玻片上，胸腔積液、腹水、尿液、腦脊液以及
懸浮的培養細胞等細胞濃度小的標本，應先用離心機以1500r/min離心10min，取沉澱塗片，干燥後
固定。②爬片法。貼壁細胞可直接培養在蓋玻片上，固定後染色。③包埋法。離心後固定細胞團，
或用瓊脂預包埋細胞後，再行常規脫水，石蠟包埋。
（3）注意事項、出現問題與解決辦法
1）取材刀具：取材刀具必須鋒利。切取標本不應擠壓和揉擦，不應使用有鉤鑷子或血管鉗等手
術器械鑷取標本，以免損害組織造成人為的組織變化。
2）取材時間：取材要及時，並及時固定，越新鮮越好。
3）取材順序：根據死後組織結構改變的速度快慢而定。先腹腔後胸腔，先消化管後肝、脾等多
血的器官，然後是神經組織、骨和皮膚等。
4）取材部位及切面方向：組織塊應包括各髒器的重要結構和主要病變部位，體積大和分葉的器
官視不同組織取多個部位。病理組織最好選取病變與正常組織交界處，以便對比；取材時應取最有
利於觀察上述部位的切面方向。如腎髒組織應包括皮質、髓質和腎盂；長骨縱切可將其組織結構完
整展現；纖維組織、肌肉組織、胃腸道、氣管等取材時盡可能按與纖維和肌肉平行走向切取為佳，避免
斜切或無規律切取。
5）取材大小及數量：組織塊力求小而薄，一般標本，以不超過1.5cm×1.5cm×0.5cm為宜，體
積小的組織，如甲狀腺和腎上腺可整體取材固定；用於免疫組化染色的組織塊宜更小而薄；冰凍切片
組織塊可略厚。較容易發脆的組織，如甲狀腺、肝髒、血塊、淋巴結、大塊癌組織等可適當厚一些，而
脂肪組織、肺組織、纖維性腫瘤、平滑肌瘤等致密的或試劑不易滲入的組織應取薄一些。組織塊的數
量依具體情況而定，一般以滿足相關研究需要為準。
6）盡量保持組織的原有形態，防止其彎曲扭轉。對神經、肌肉、皮膚等組織則可將其兩端用線
扎在木片或硬紙片上固定。胃腸、胰腺等組織，應先平展於草紙上黏著以後，慢慢地放入固定液中。
標本上附著的軟組織，如脂肪等，應在不影響觀察的原則下，盡量剝去或切除。組織塊上如有血液、
黏液、污物等，應先用生理鹽水衝洗，然後再投入固定液。
7）骨組織或組織內的鈣化灶，應在固定之後進行脫鈣，再行修切。
2.固定
（1）主要實驗儀器/器材/重要試劑
1）10%緩衝甲醛固定液：甲醛100ml，蒸餾水900ml，NaH2PO4·H2O4g，Na2HPO4（無水）6.5g。
2）4%多聚甲醛固定液：多聚甲醛40g，蒸餾水600ml，加熱，邊加適量的NaOH慢慢溶解後，將
pH調至7.2～7.4，加入NaH2PO4·H2O4g，Na2HPO4（無水）6.5g，蒸餾水定容到1000ml。
（2）實驗操作
1）組織放入固定液後，常溫放置24～48h。
2）根據組織塊大小，流水衝洗數小時後再進行後續操作。
（3）注意事項、出現問題與解決辦法
1）組織固定越新鮮越好。
2）組織塊不宜過大。
3）組織固定時間不宜太短，也不宜太長。
4）固定液的量要充分，固定液的量與組織的體積比應達到10∶1左右。
5）合理選擇固定液。一般的標本都可以應用甲醛固定液來固定，但是甲醛對一些特殊物質固
定不好，如要顯示糖原，要選擇無水酒精或丙酮來固定組織；顯示狂犬病毒的包含體，必須采用丙酮
來固定等。
6）甲醛固定後要充分衝洗，否則可能會對各種染色造成影響。
3.脫水、透明、浸蠟
（1）主要實驗儀器/器材/重要試劑
1）脫水機或磨砂口的玻璃缸。
2）無水乙醇，95%乙醇，蒸餾水。將無水乙醇或95%乙醇與蒸餾水按比例配成70%、80%、
90%濃度的乙醇溶液。
3）二甲苯。
4）熔點為52～54℃（軟蠟）和58～60℃（硬蠟）的石蠟。
（2）實驗操作
1）脫水：70%乙醇1～2h，80%乙醇1～2h，90%乙醇1～2h，95%乙醇1～2h，100%乙醇Ⅰ
0.5h，100%乙醇Ⅱ0.5h，100%乙醇Ⅲ1～2h。
2）透明：二甲苯Ⅰ30min，二甲苯Ⅱ1～2h。
3）浸蠟：石蠟加熱到60～65℃使其處於熔解狀態，軟蠟0.5h，硬蠟Ⅰ0.5h，硬蠟Ⅱ1～2h。
（3）注意事項、出現問題與解決辦法
1）乙醇脫水力強，但對組織有收縮、硬化和易脆的不良影響。因此，在使用時，通常是從低濃度
至高濃度；時間不宜太短，也不宜太長，應根據組織的大小和質地靈活調整。
2）二甲苯易致組織脆硬，因此，透明時間不宜過長，可隨時觀察，組織完全透明後即止。
3）乙醇和二甲苯易揮發，且經脫水、透明後濃度易發生改變，應及時更換。
4）蠟在高溫下對組織和固有物質會有影響，因此浸蠟時間不宜太久。浸透後應立即包埋，如需
耽擱，應停止加熱讓其降溫凝固，包埋時再加熱溶解。
5）熔化石蠟必須在熔蠟箱內進行，不得用明火加溫，且溫度不得超過65℃。
6）熔蠟應及時過濾、更換。
4.包埋
（1）主要實驗儀器/器材/重要試劑
包埋機、冷凍臺、一次性包埋盒、包埋模具、鑷子等。
（2）實驗操作
1）打開包埋機，讓石蠟預熱至65℃左右；打開冷凍臺預冷。
2）在包埋盒上標記好標本序號。
3）先將熔化的石蠟傾入包埋模具中，再用加熱的鑷子輕輕夾取已經過浸蠟的組織塊，使組織塊的
最大面或切面向下埋入熔蠟中；包埋於同一蠟塊內的多塊細小組織應靠近並盡量位於同一平面上。
4）蓋上包埋盒，將包埋盒的背面凹槽用熔蠟填充。
5）待包埋模具內的熔蠟凝固後，將蠟塊取出備用。
（3）注意事項、出現問題與解決辦法
1）包埋時要認真核對組織塊的標本號順序。
2）必須嚴防各種異物污染，勿將無關組織埋入蠟塊內。
3）包埋過程要操作迅速，以免組織塊尚未埋妥前熔蠟凝固。
4）包埋塊內避免氣泡產生，可用加熱的鑷子去除。
5）包埋定向組織時要注意將切面朝下，管腔組織和皮膚等需立埋。
5.切片
（1）主要實驗儀器/器材/重要試劑
包埋機、水浴鍋、烘片機或烤箱、切片刀、毛筆、載玻片等。
（2）實驗操作
1）將要進行切片的組織塊固定於切片機標本架上，旋緊。
2）調整好樣品面與切片刀在X/Y/Z軸的合適位置，調整好樣品面與切片刀間距離。
3）修平切面，如果沒有特定標志，原則上是暴露組織的最大切面。
4）根據需要設置切片厚度並進行切片（一般4～8μm），用毛筆收集蠟帶。
5）選擇佳片放入恆溫水浴鍋內展平後裱片，使切片平整地貼附在載玻片上。
6）放入烘片機或烤箱內烘片3～5h，使切片牢牢黏附在載玻片上。
（3）注意事項、出現問題與解決辦法
1）切片刀必須鋒利，切片時刀口從一側開始使用，用鈍後按順序挪動一個刀口，避免損傷的舊
刀口重復使用和浪費新刀口。
2）切片速度要均勻，以40～50次/min為宜。
3）切勿使毛筆觸及刀刃，以免傷及刀口。
4）載玻片要清洗干淨，以免影響切片黏附，必要時可用多聚賴氨酸等防脫處理。
5）裱片水溫要適宜（40～45℃）、潔淨，每切完一個蠟塊後，必須認真清理水面，不得遺留其他的
組織碎片。如切片不易展開，可先放入30%乙醇中預展片，再放入溫水中。
6）烘片溫度和時間要適宜（60℃3～5h），時間過長、溫度過高易導致固有物質受影響，尤其在
免疫組化原位雜交時；溫度低、時間短易導致切片黏附不牢而掉片。
6.H-E染色、封固
（1）主要實驗儀器/器材/重要試劑
1）蘇木素：Harris蘇木素。蘇木素2.5g，無水乙醇25ml，硫酸鋁鉀（鉀明礬）50g，或硫酸鋁銨
（銨明礬），蒸餾水500ml，黃色氧化汞1.25g，冰醋酸20ml；配制溶液時，先將蒸餾水稍加溫，加入蘇
木素並不停攪拌直至完全溶解，繼而加入硫酸鋁鉀，令其充分溶解後，加入檸檬酸和水合氯醛，繼續
攪拌均勻，全部溶解後再加入碘酸鈉，攪拌均勻，此時溶液的顏色變為深棕色，過濾後即可使用。
Ehrlich蘇木素。蘇木素1g，無水乙醇50ml，甘油50ml，硫酸鋁鉀7.5g，蒸餾水50ml，冰醋酸5ml；將
蘇木素溶於無水乙醇裡，硫酸鋁鉀溶於蒸餾水中，然後所有的試劑都加在一起，充分攪拌均勻後，放
於陽光充足的地方慢慢氧化成熟，大約4周纔可使用。
2）0.5%伊紅：伊紅1g，70%～75%乙醇200ml；先將伊紅用蒸餾水（少許）調成糨糊狀，再加入乙
醇，邊加邊攪拌，直到徹底溶解，此時試劑有些混濁，加入少許冰醋酸，試劑逐漸轉變為清亮，呈鮮紅色。
3）1%鹽酸乙醇：70%乙醇100ml，鹽酸1ml。
4）染色缸，染色架，蓋玻片，梯度乙醇，二甲苯，中性樹膠。
（2）實驗操作
1）二甲苯脫蠟（2缸）各10～15min。
2）梯度乙醇入水：無水乙醇，95%、90%、80%、70%乙醇，蒸餾水各5～10min。
3）Ehrlich蘇木精液染色20～30min或Harris蘇木素2～3min。
4）流水洗去蘇木精液，1%鹽酸乙醇1～3s，水洗，返藍20～30min。
5）伊紅液染色1～3min，快速水洗。
6）梯度乙醇脫水（與入水相反），二甲苯透明2～3min，中性樹膠封片。
（3）注意事項、出現問題與解決辦法
1）Harris蘇木素成熟快，染色快，但隻能用3個月左右就慢慢失效；Ehrlich蘇木精成熟慢，染色
久，但用它染後，細胞核染色清晰，不易過染，可長期使用，對於用酸脫鈣組織細胞核的染色，該試劑
優於其他各種蘇木素，可根據需要選擇。
2）二甲苯脫蠟要徹底，時間為10～20min，試劑要及時更換，否則均影響染色。
3）蘇木精液染色液每次染色前應過濾或用紙把液面的氧化膜去除，以免污染切片。
4）染色過程中所用的時間要根據染色時的室內溫度、染液的新鮮程度等靈活掌握。
5）低濃度乙醇對伊紅有分化作用，切片經低濃度乙醇脫水時間不宜久置。
6）蘇木素過染用1%鹽酸乙醇分色，伊紅過染用低濃度乙醇分色；若染色太淺均可再染。
7）中性樹膠用二甲苯稀釋後再用，封片時避免產生氣泡。
四、幾種特殊組織切片技術
（一）骨組織脫鈣切片制備
骨骼組織是一種堅硬的結締組織，有機成分凝膠和無機成分骨鹽兩種成分緊密結合形成骨基
質，使其變得十分堅硬，不能直接制片。因此，需脫鈣處理，使鈣鹽溶解，組織變軟後纔能制作石蠟切
片。脫鈣後制作方法同軟組織。在諸多脫鈣方法中，EDTA脫鈣法是一種較為理想的、可行的方法。
1.主要實驗儀器/器材/重要試劑
10%EDTA脫鈣液：EDTA10g，先用600～800ml蒸餾水將其溶解（需加適量NaOH助溶），然後
加蒸餾水至1000ml，調pH至7.2～7.4。
2.實驗操作
1）將1cm×0.5cm×0.3cm大小的骨組織浸泡在5～10倍的EDTA脫鈣液中。
2）脫鈣時間：一個月左右，具體視標本大小、室溫而定。
3）效果判定：用大頭針扎入脫鈣後的骨組織，沒有明顯阻力，類似軟組織即可。
3.注意事項、出現問題與解決辦法
1）脫鈣液要勤換，每2～3天更換新液一次，否則影響脫鈣速度。
2）標本不可太大，可在脫鈣過程中組織較軟後二次修切，以加快脫鈣速度。
3）震蕩、加溫和微波等可加快脫鈣速度，但溫度不可過高，否則影響組織的抗原性等。
（二）不脫鈣骨組織切片
硬質切片也稱不脫鈣骨組織切片，因不脫鈣而保持鈣鹽分布。以丙烯酸樹脂（GMA），TBBA環
氧樹脂及甲酯甲基丙烯（MMA）等包埋，結合硬質切片機切片，用於骨組織形態學研究，如哈弗管、骨
小梁的觀察。這裡以MMA包埋為例。
1.主要實驗儀器/器材/重要試劑
1）洗滌劑：稱取氫氧化鈉50g，氯化鈉200g，加蒸餾水至1000ml溶解備用。
2）MMA準備：①洗滌：洗去MMA單體中的阻聚劑，將MMA與洗滌劑按2∶1體積比加入分液漏
鬥，充分搖勻，靜置分離，棄去下層，共2次；②用蒸餾水洗3次，方法同上；③吸水：無水氯化鈣吸水
30min，過濾去水；④貯存：2～4℃保存。
3）過氧化苯甲酰（市售試劑含水）使用前作干燥處理，將試劑盛於玻璃平皿，置干燥器待水分吸
干備用。
4）MMAⅠ液配制：加速劑過氧化苯甲酰1.5g溶於100mlMMA。
5）MMAⅡ液配制：加速劑過氧化苯甲酰3.5g溶於100mlMMA。
6）各級乙醇，二甲苯。
2.實驗操作
1）常規固定、乙醇脫水與二甲苯透明。
2）MMAⅠ液24h×2次。
3）MMAⅡ液24h×3次。
4）加入MMAⅡ液，抽真空30min，待氣泡完全排出，蓋上瓶蓋，用密封紙封口，於室溫下約7d時
間開始凝結，並逐漸變硬。
5）硬質切片機切片80μm，常規裱片，染色。
3.注意事項、出現問題與解決辦法
1）包埋必須在徹底脫水和滲透之後進行。
2）包埋時溫度不宜過高，以不超過40℃為宜。
3）市售MMA含有穩定劑防止固化，使用前需洗去穩定劑方可使用。
4）骨切片在染色時易脫片，因此載玻片應作防脫處理。
（三）冷凍切片的制作方法
冷凍切片是直接用新鮮組織冰凍後獲得一定的硬度，然後進行切片制作，目前主要用於臨床術
中快速診斷和脂溶性物質的檢測，以及其他在組織常規石蠟切片制作過程中易受影響的物質的檢
測，如一些酶類等。
1.主要實驗儀器/器材/重要試劑
冷凍切片機，冷凍切片包埋劑，載玻片，固定液等。
2.實驗操作
1）打開冷凍切片機預冷，降至所需溫度；
2）取出組織支撐器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放於冷凍臺上冰凍。
3）將冷凍好的組織塊，夾緊於切片機支撐器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。
4）調好欲切的厚度，一般在5～10μm間。
5）調好防卷板至適當的位置。
6）切出切片後，取一載玻片，將其附貼上。
7）將切片放入固定液固定1min後即可染色。
3.注意事項和出現問題與解決辦法
1）防卷板和切片刀應保持干淨，不得有殘餘的包埋劑黏於刀或板上，否則會破壞甚至撕裂
切片。
2）組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。如果
使用未完全固定的組織作冰凍切片，就會出現冰晶，影響切片。
3）應視不同的組織性質選擇不同的冷凍度。如：切腦組織、肝組織和淋巴結，在-15～-10℃
左右；切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調在-20～-15℃左右；切帶脂肪的組織應調至-25℃左
右，組織含大量的脂肪時，應調至-30℃。
4）用於附貼切片的載玻片最好經防脫處理，以防掉片。載玻片不能存放於冷凍處，於室溫存放
即可，否則切片不易黏附。
（黃雲梅黃美雅）
第二節光鏡組織化學與特殊染色
一、簡介
特殊染色是常規染色（HE染色）的必要補充，也是染色技術中一個不可缺少的組成部分。HE