章 中藥抗氧化的研究

節 自由基和氧化傷害

第二節 中藥抗氧化成分及其作用機制

第三節 中藥抗氧化活性測定方法

第四節 中藥抗氧化成分的提取、分離及分析技術

第二章 苯乙醇苷類化合物

節 概述

第二節 車前子

第三節 車前草

第四節 肉苁蓉

第五節 玄參

第三章 人參皂苷類化合物

節 概述

第二節 人參

第三節 西洋參

第四節 三七

第五節 人參

第四章 黃酮類化合物

節 概述

第二節 山楂

第三節 金蓮花

第四節 銀杏葉

第五節 生姜

第六節 仙人掌

第七節 馬齒苋

第八節 荞麥

第五章 生物堿類化合物

節 概述

第二節 鉤籐

第三節 吳茱萸

第四節 蘿芙木

第五節 荷葉

第六節 長春花

第六章 蒽醒類化合物

節 概述

第二節 決明子

第三節 虎杖

第七章 多糖類化合物

節 概述

第二節 枸杞

第三節 刺五加

第四節 葛根

第五節 靈芝

第六節 蘆荟

第七節 蛹蟲草

第八節 防風

第九節 麥鼕

章中藥抗氧化的研究

自1956年Harman在生物學基礎上提出衰老自由基學說以來，人們對自由基的產生及

其對人體的危害有了越來越深刻的認識。大量研究發現，過量的自由基可以攻擊生物膜不

飽和脂肪酸和蛋白質等，引發氧化損傷，使機體抵抗力下降，從而導致各種疾病發生，如癌變

和老化等病理性變化。所以，尋找能有效清除人體多餘自由基的藥物已引起人們的廣泛關

注。目前，在食品、化妝品以及藥品等許多領域廣泛使用的合成抗氧化劑，如BHT、BHA、

PG等雖具有較好的抗氧化性能，但長期使用具有明顯的不良反應。傳統中藥在緩解衰老

以及衰老性疾病的防治方面有著極為豐富的實踐經驗。現代藥理學研究表明許多中草藥具

有提高抗氧化酶活性、降低氧化酶活性或直接清除氧自由基作用。

節自由基和氧化傷害

一、自由基及其形成

自由基（reactive oxygen species，ROS）是機體在生化反應中產生的性質活潑的具有極

強的氧化功能、可以導致機體衰老的物質。在化學結構上，自由基是指外層軌道上含有一個

或一個以上未配對電子的分子、原子、離子或基團。因而表現出順磁特性，不成對電子具有

成對趨向，奪取或失去一個電子構成成對電子，因此自由基具有較強的化學性質，極易和其

他物質反應形成新的自由基，呈現明顯的連串反應。

自由基的形成有生化、化學、物理等多方面的因素，但主要是來自人體內的生化反應，如

各種酶的催化反應或疾病（炎癥、缺血、心肌梗死等）都可以產生大量自由基。此外，一些化

學物質（如腐敗、霉變食物、殺蟲劑、農藥等）、空氣污染、輻射、運動和心理壓力等都會激發活

性氧和自由基的產生。人體在氧的利用過程中，會因各種內因性和外因性因素而產生各種

活性氧和自由基，這些自由基在維持機體正常代謝和疾病防治中起到積極的作用。

人體內的自由基主要包括超氧陰離子（O-

2·）、羥自由基（·OH）、氫自由基（H·）、有機

自由基（R·）、單線態氧（1O2）、過氧化氫（H2O2）、臭氧（O3）及脂類過氧化自由基（LOO·）和脂

類自由基（L·）等［1~13］。

二、氧化傷害、疾病與氧化防御繫統

為維持身體的正常功能，抵御各種活性氧和自由基對器官和組織的傷害，體內有各種清

除活性氧和自由基的抗氧化物質，如抗氧化酶類、蛋白質類和抗氧化維生素等。抗氧化酶類

主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷

胱甘肽轉移酶（GS-T）等，這些酶是機體內部的道防線，但會隨著年齡的增長而下降；蛋

白質類包括鐵傳遞蛋白、肝球蛋白、血紅素結合蛋白等；抗氧化維生素有維生素C、尿酸、α-

維生素E、γ-維生素E、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等。

當活性氧和自由基濃度超過生理限度時，多餘的自由基成為有害物質，攻擊脂質、蛋白

質、糖類和脫氧核糖核酸等大分子物質，發生各種氧化反應，引發各種氧化損傷，進而導致細

胞結構和功能的變化，使機體抵抗力下降，從而導致各種疾病發生，如癌癥、動脈硬化、心腦

血管疾病、肝腎損傷、糖尿病、缺血再灌流障礙等多種疾病。氧化導致疾病的主要原因之一

是血液中的不飽和脂肪酸因氧化而成為過氧化物質，經小腸吸收、經淋巴和血液而流入各組

織，發生有害作用。

為加強防御繫統，促進機體的健康，就有必要從體外補充各種具有抗氧化能力的物質，

包括抗氧化食品和藥品［2］。

第二節中藥抗氧化成分及其作用機制

研究表明很多中藥提取物或從中分離得到的單體化合物可抑制自由基的產生，或直接

對抗自由基對組織及細胞的損傷，或直接清除自由基，還可增強機體本身抗氧化繫統的功

能，從多個環節阻斷自由基的損傷作用。如來源於中藥中的黃酮［14~16］、生物堿［17~22］、皂

苷［23~30］、醌類［31~34］、酚類［35］、多糖等［36~38］都具有很好的抗氧化活性。

中藥抗氧化的作用機制主要表現在如下幾個方面［39~41］。

1.清除自由基機體在正常細胞代謝中產生的O-

2·、·OH、H2O2、1O2等自由基可

誘發機體內不飽和脂肪酶的一繫列脂質氧化連鎖反應，造成生物膜結構和功能損傷，並可破

壞核酸、蛋白質等生物分子，導致人體的衰老和死亡［41］。大量研究表明很多中草藥具有清

除自由基的作用。何首烏、山楂、五加皮、益母草、女貞子、甘草6種藥物水提液對具有細胞

損傷作用的超氧陰離子自由基（SAFR）和羥自由基（HFR）均有清除作用，並能抑制羥自由

基（HFR）所誘發的膜脂質過氧化LPO反應［42］。羌活、川芎、柴胡、獨活、蛇床子、小茴香、當

歸、北沙參、白芷、藁本、白花前胡、防風及川黨參13種傘形科中藥95%乙醇提取液對超氧

自由基均有清除作用，其中羌活、川芎、柴胡醇提液抗O-

2·的能力強。提取液的加入量

與抑制O-

2自由基的能力呈現明顯的量效關繫［43］。在連苯三酚自氧化體繫中，山楂、薏仁

和三七的石油醚提取物，茵陳、柴胡、青蒿的乙醇提取物，以及茵陳、柴胡、桑皮、薏仁的水提

取物都具有較好的抑制連苯三酚自氧化、清除超氧陰離子的作用。其中山楂的石油醚提取

物和柴胡的乙醇提取物抗氧化效果強［44］。山楂、白蒺藜及枸杞乙醇和水浸提物在卵黃脂

蛋白不飽和脂肪酸（PUFA）過氧體繫中，山楂和白蒺藜具有一定的清除·OH的能力；3種

中藥均具有較強的清除O-

2·的能力［45］。十大功勞具有清除O-

2·和·OH的能力，在一定

範圍內隨藥物濃度的升高而增強［46］。Ni等采用電子順核磁共振技術證實枸杞多糖清除羥

自由基作用非常顯著［47］；Wang等也發現枸杞多糖對Fe2+-H2O2產生的羥自由基具有強烈

的清除作用，並呈明顯的劑量相關性［48］。

2.增強抗氧化酶活性機體內存在著自由基防御酶和酶促繫統，如超氧化物歧化酶

（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，它們能清除自由基，保護機

體免受損傷［49］。其中SOD和GSH-Px是機體清除自由基的主要抗氧化酶，紅景天、沙棘、

刺五加、羅布麻、絞股藍、螞蟻等中藥可提高機體SOD含量和活性，增強機體對自由基損害

的防御能力。Li等［50］證實枸杞子水提物在體內能顯著升高急性缺氧小鼠心、肝、肺等器官

組織中的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性以及總抗氧化能力，枸杞子對小鼠由急性缺氧

而造成的自由基損傷有保護作用。

3.降低脂質過氧化物（LPO）含量LPO含量增加，可引起內皮細胞生物膜繫統損傷，

影響細胞的功能。丙二醛（MDA）是主要的脂質過氧化產物，其含量反映了機體細胞受脂質

過氧化損傷的程度［51］。李自成等［52］報道，當歸注射液能抗脂質過氧化反應，降低MDA水

平。臨床應用丹參治療後，血中LPO含量明顯降低［53］。

4.能量代謝的影響線粒體是細胞能量代謝的中心，研究表明衰老時，線粒體會發生

腫脹、變性、空洞化、數量減少等一繫列退行性變化，所以線粒體被認為在細胞衰老中起到重

要的作用［54，55］。琥珀酸脫氫酶（SDH）和線粒體內膜緊密結合，是受氫體中重要的酶，不

需要輔酶，自身有黃素蛋白作為輔基，在組織反應中常用來反映三羧酸循環的情況，成為線

粒體的標志酶。葛迎春等研究表明人參皂苷能增加不同年齡的人胚肺成纖維細胞中SDH

的含量，維持了細胞能量代謝的穩定性，並且提高了衰老細胞的增殖率［56］。

5.增加膽堿繫統或腦內神經遞質學習和記憶是大腦高級功能之一，而記憶力的減退

是動物老化的早期癥狀之一。現代研究已證實神經遞質及其受體的變化與腦功能的衰老有

密切關繫，表現為學習與記憶力障礙。乙酰膽堿（ACh）是中樞膽堿能神經繫統的重要遞質。

它由乙酰轉移酶（ChAT）合成，乙酰膽酯酶（AChE）分解，通過乙酰膽堿受體（ACh-R）發揮

生物學效應。ChAT和AChE共同維持ACh平衡。隨著生物體年齡增長，膽堿能繫統功能

逐漸衰退，表現為代謝失調、受體數目和親和力的變化，導致中樞神經生理異常。增加大鼠

海馬ChAT的活性，可提高大鼠空間學習的能力［57］。

6.基因調控學說細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞在周期時相的變遷中進

入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態。細胞周期運轉十分有序，沿著G1期—S期—G2

期—M期的順序進行，G1期是啟動細胞周期循環的關鍵。細胞衰老顯著的特征是細胞

在很長一段時間內仍維持代謝活性，但因阻滯於G1期，失去了對有絲分裂原的反應和合成

DNA的能力，不能進入S期。在衰老的成纖維細胞中，其細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期

蛋白依賴激酶（CDK）、CDK抑制因子發生量與活性的變化。cyclinE是一種周期性表達的

細胞周期蛋白，在G1期與S期交界處，與CDK一起發揮其蛋白激酶的活性，是細胞從G1

期進入S期的關鍵性周期蛋白。

趙海花等探討了人參皂苷對老齡大鼠NBTrkBmRNA表達的影響［58］，結果

顯示老齡組大鼠NBTrkBmRNA表達顯著低於青年組，而給藥組較老齡組大鼠

表達增多。

7.保護DNA自由基可造成DNA單、雙鏈斷裂以及堿基損傷，使細胞發生突變。

DNA分子的損傷又使主要的酶表達缺乏，引起細胞死亡［51］。呂明莊等［59］報道，蘆荟可以有

效減輕臭氧衰老模型中小鼠肝、脾細胞DNA的損傷程度。

第三節中藥抗氧化活性測定方法

生物體在進行氧化還原反應的過程中伴有活性氧的產生，不同的中藥對不同的氧自由

基清除效果各異，機制也各不相同，所以應根據不同的中藥以及氧自由基建立其相應的檢測

方法來評價中藥的抗氧自由基活性。

1.鐵離子還原法鐵離子還原法（ferric reducing antioxidant power，FRAP）是一種測

定物質總的抗氧化能力的方法，具有快速、易於操作、重復性好等優點。該方法已廣泛用於

抗氧化活性物質的分析測定。其原理是基於氧化還原反應的比色法，在低pH的溶液中，

Fe3+-TPTZ（Fe3+-三吡啶三嗪）被抗氧化劑還原成Fe2+-TPTZ，使反應液變成深藍色，在

593nm處有光吸收，這樣通過測量樣品吸光度的變化來測量其抗氧化能力［60］。

實驗中將Acetate緩衝液（300mmol/L，pH3．6），10mmol/LTPTZ（溶解在40ml

HCl）和20mmol/LFeCl3以10∶1∶1（V∶V∶V）比例混合，配制成FRAP試劑。需要注

意的是FRAP試劑一定要新鮮配制。取10μl的標準品或樣品溶液，迅速加入300μlFRAP

試劑，混勻。測試溫度為37℃，儀器波長為593nm，測量時間為4min。樣品FRAP測量值

通過1000μmol/L的L-ascorbicacid來計算。計算公式如下［61］：

FRAP值（μmol/L）＝（0~4minΔA593nm樣品）/（0~4minΔA593nm標準品）×500×2（μmol/L）


2.β-胡蘿卜素-亞油酸法（β-carotenebleachingtest，β-CLAMS）β-胡蘿卜素是一種多

烯色素，容易被氧化而褪去黃色，在反應介質溶液中，由亞油酸（linoleicacid）氧化產生的過

氧化物能使β-胡蘿卜素褪色，隨著時間的延長吸光度越來越小。加入抗氧化劑後，β-胡蘿卜

素降解速率減少，其降解的程度與體繫中抗氧化活性物質的強弱有關，抗氧化能力越強，降

解越慢，這樣在波長491nm處通過測量所有樣品的吸收度，根據吸光度曲線便可分析抗氧

化劑的抗氧化能力［62］。

將25μl亞油酸和200mg吐溫40溶解在2ml氯仿溶液中，加入0．5mgβ-胡蘿卜素，利

用旋轉蒸發儀在減壓條件下揮干氯仿（＜40℃），然後加入100ml氧化水（HPLCgrade），制

得測試混合液（新鮮配制）。35μl水（空白液），標準品（2，6-二叔丁基對甲酚，BHT）或樣品

溶液中迅速加入250μl測試混合液。測試溫度為45℃，波長為491nm，每15min測一次，一

共運行180min［63］。

3.PCL方法實驗采用Photochem棆（Berlin，Germany）超快速抗氧化劑和自由基全自

動分析儀。該設備可以測定水溶性或脂溶性物質的抗氧化能力，並用相當於維生素C（水溶

性物質）或Trolox（脂溶性物質）當量值表示測定結果。該法具有很高的靈敏度，能測出

10-9mol/L級濃度的非酶抗氧化物，測定時間短。其原理是由光化學法生成自由基，並利用

化學發光法檢測自由基。在實驗中使用具有光化學激發作用的光敏劑（photosensitizer，發

光氨）激發反應分子，使之在紫外燈的作用下以比正常條件下快1000倍的速度發生氧化反

應，迅速產生自由基。發光氨（luminol）是一種光致化學發光物質，通過測量反應所生成的

光強度來測量自由基的瞬間含量（光強與自由基含量成正比）［63］。

實驗中需要稀釋樣品溶液，以使滯後時間距（lag-phase）落在標準曲線的線性範圍內。

Photochem棆產生標準曲線和測試樣品的抗氧化活性都是自動進行的，樣品的抗氧化活性是

用相當於L-ascorbicacid或Trolox的納摩爾數來計算。

4.DPPH·分析方法二苯基苦味肼基自由基［DPPH·］是一種穩定的以氮為中心的

自由基，在515nm波長處有吸收。［DPPH·］甲醇溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線

性關繫。在［DPPH·］甲醇溶液中加入抗氧化劑後，抗氧化劑可以與［DPPH·］自由基結

合或發生替代，使［DPPH·］自由基數量減少，溶液顏色變淺，表現為其在515nm波長處的

吸光度不斷減小，直至達到穩定。

實驗中配置一定濃度的［DPPH·］溶液，以濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標制作［DPPH·］

·4·中藥抗氧化成分的現代分離和分析技術

 

標準曲線方程。之後配制不同濃度的樣品和標準品溶液，分別取0．1ml樣品或標準品溶

液，加入3．9ml質量濃度為2．5mg/100ml［DPPH·］標準液（現用現配）。乙醇溶液為空白

對照，將混合溶液搖勻，用比色皿在515nm波長處測定其在不同時間的吸光度值，根據標準

曲線方程換算成［DPPH·］的質量濃度，計算出［DPPH·］殘留率。根據［DPPH·］殘留

率和相應的樣品添加量，繪制樣品清除［DPPH·］自由基的曲線。根據［DPPH·］的質量

濃度與吸光度的關繫曲線，將添加自由基清除劑後測得的吸光度換算為［DPPH·］的質量

濃度，計算出添加自由基清除劑後的［DPPH·］殘留率，計算公式如下：

［DPPH·］REM＝［DPPH·］T/［DPPH·］T＝0×100%

其中［DPPH·］T為自由基清除過程中某一時刻DPPH·的質量濃度，［DPPH·］T＝0為

DPPH·的原始質量濃度。

根據抗氧化劑添加量與［DPPH·］殘留率，制作二者的關繫曲線，通過線性回歸分析可

以得到回歸方程，根據回歸方程式可以計算出［DPPH·］殘留率為50%時的抗氧化劑量即

半抑制量（EC50）和自由基清除能力AE（antiradical efficiency），AE＝1/EC50

［64］。

5.清除羥自由基（·OH）的作用按Fenton反應原理，Fenton反應體繫鄰二氮菲-Fe2+氧

化法進行測定，芬頓反應產生·OH，向體繫中加入的是·OH產生的抑制劑，則·OH減少，呈色

反應的吸光度也相應地減少。

取1．5ml0．1mol/L鄰二氮菲分別放入試管中，加入4．5ml0．1mol/LpH＝7．4磷酸鹽

緩衝液，混勻後加入1ml0．001mol/LFeSO4溶液，立即混勻，分別加入1ml一定濃度的試

樣，然後加入1ml0．1%H2O2啟動反應，於37℃保溫60min，510nm處測定吸光度值。同時

設置損傷管（加入1ml蒸餾水代替樣品液，1ml0．1%H2O2啟動反應）和未損傷管（加入2ml

蒸餾水代替樣品液和H2O2）以相同濃度的維生素C作對比實驗，其中損傷管和未損傷管以

磷酸鹽緩衝溶液調零，加藥管以同濃度不加H2O2的加藥管調零。按下式計算羥基自由基

的清除率：

OH·的清除率（%）＝（A加藥-A損傷）/（A未損-A損傷）×100%［65］

6.超氧陰離子自由基（O-

2·）清除能力測定利用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應繫統產

生超氧陰離子自由基，當加入電子傳遞物質及Gress顯色劑後，溶液呈現紫紅色，在550nm

下測定其吸光度。以0．15mg/ml維生素C為樣品對照，以蒸餾水做空白對照，具體操作過

程按照試劑盒說明進行。按照下面公式計算其清除率。清除率（%）＝（Ab-AS）/Ab×100，

式中：Ab為空白對照管的吸光度值，AS為樣品測定管的吸光度值［66］。

7.鄰苯三酚法按鄰苯三酚自氧化反應方法，取6支比色管分別移取50mmol/L

（pH8．2）的Tris-HCl緩衝溶液4．5ml，在2~6號比色管中分別加0．5ml濃度為0．07、

0．14、0．28、0．42、0．56mg/ml的樣品溶液，置於25℃水浴中預熱20min，再向這5支試管中

加入25℃預熱的3mmol/L鄰苯三酚0．3ml立即混勻後，在30s內用蒸餾水補至25．0ml，

後在25℃水浴中準確反應4min，立即滴加0．5ml濃度為8mol/LHCl終止反應。在325nm

處測定吸光度。以等體積pH2的Tris-HCl緩衝液作為空白。吸光度越低，清除超氧陰離

子自由基效果越好。超氧陰離子的清除率＝（A0-A1）/A0×100%式中，A0為空白對照組

吸光值；A1為某濃度黃酮溶液的吸光值。

鄰苯三酚-魯米諾-碳酸緩衝液體繫產生的超氧陰離子（O-

2·）的清除能力，采用化學發

光法，在發光杯中加入10μl樣品溶液（以10μlDMSO作空白對照）和20μl鄰苯三酚溶液，

加入魯米諾-碳酸緩衝液混合溶液啟動反應，記錄發光強度（CL），計算各供試品對O-

2·的

清除率，自由基清除率（%）＝（CL空白-CL樣品）/CL空白×100%，以高濃度逐漸稀釋的方法檢

測不同濃度樣品對自由基的清除率，采用BPCLAppl7．2數據處理工作站計算各化合物

IC50，以IC50作為活性評價指標［67，68］。

8.脂質過氧化值測定法分別精密稱取樣品5、15、25、35mg，用5ml乙醇溶解，加入到

裝有15g熔化豬板油的碘量瓶中，不時攪拌成勻相，使抗氧化劑充分擴散進油樣中。置於

70℃恆溫箱中強化保存，每隔12h攪拌1次，並交換在培養箱中的位置，確保環境條件相同。

5d後測定其過氧化值（POV），以不加抗氧化劑的油樣為空白對照（CK）。采用國標方法

（GB/T5538-1995）測定POV值，POV的計算公式如下：POV＝C×（V1-V2）×0．1269×

100。式中，POV為樣品過氧化值（mmol/100g）；C為硫代硫酸鈉標準溶液的摩爾濃度

（mol/L）；V1為樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積（ml）；V2為空白試驗消耗硫代硫酸鈉

標準溶液的體積（ml）；m為樣品質量（g）；0．1269為與1mlNa2S2O3標準滴定溶液相當的碘

的質量（g）。取2g混勻的樣品，置於碘量瓶。加入10ml三氯甲烷及15ml冰乙酸和1ml碘

化鉀飽和溶液迅速蓋好瓶塞，混勻1min，避光靜置5min。然後加入50ml蒸餾水，充分混合

均勻，立即用2mmol/L硫代硫酸鈉標準溶液滴定至淺黃色時，加入1ml澱粉指示劑，繼續

滴定至藍色消失為止，記下體積V1，計算POV值［69］。

9.清除ABTS+自由基法用ABTS評價一些化合物的抗氧化能力方法，根據這些待

測化合物清除預先生成的ABTS+自由基的能力來評價其抗氧化活性。同時測定多個樣

品，可以使用酶標儀來評價物質的抗氧化活性［70］。將5ml的7mmol/LABTS和88μl的

140mmol/L高硫酸鉀混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成ABTS+自由基儲備液。

該儲備液在室溫、避光的條件下穩定。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求當在200μl工

作液中加入50μl無水乙醇時其在30℃、734nm波長下的吸光度為0．51±0．02。在96孔酶

標板的每孔中加入50μl的標準或樣品，再加入200μl的ABTS+工作液，以250μl的無水乙

醇為空白，混合10s，30℃靜置6min，在734nm波長下讀取吸光度。以Trolox作為參照物，

使用的標準繫列為20、40、60、80、100和120μmol/L。將待測物質清除自由基的能力與

Trolox清除自由基的能力相對比，確定其相對抗氧化活性，單位為TEAC（troloxequivalent

antioxidantcapacity，Trolox抗氧化當量），即1μmol/L待測物質的自由基清除能力相當於

Trolox的自由基清除能力的微摩爾數。在實驗中，標準曲線和TEAC值可由隨機軟件直接

給出，也可以通過計算得出。為反映提取抗氧化活性物質的效率，其抗氧化活性表示為從

1g樣品中提取出的抗氧化物質的自由基清除能力相當於Trolox的自由基清除能力的微摩

爾數。

10.清除H2O2法取4．5ml0．1mol/LpH＝7．4磷酸鹽緩衝液，加入2ml0．05%

H2O2後加入1ml一定濃度的試樣，立即混勻，在340nm處測定吸光度值A1。實驗中以不

加試樣的H2O2吸光度為A0以不加H2O2的試樣溶液的吸光度為A2，按如下公式計算其

平均值：H2O2的清除率（%）＝［A0-（A1/A2）］A0×100［71］。