第一章適合重組蛋白表達的哺乳動物細胞 1
第一節CHO細胞表達繫統 3
一、CHO細胞歷史與分類 3
二、CHO細胞表達繫統的優點 10
三、CHO細胞培養 13
第二節HEK293細胞表達繫統 17
一、HEK293細胞的分類與優點 17
二、HEK293細胞培養與鋻定 19
第三節其他哺乳動物細胞 21
一、人源化細胞繫 21
二、非人源化細胞繫 23
參考文獻 24

第二章基因工程 28
第一節基因工程簡介 28
一、基因工程概念 28
二、基因工程的發展史 29
三、基因工程的應用和基因工程醫藥的前景 32
第二節哺乳動物細胞基因工程 35
一、目的基因獲取 36
二、載體繫統 37
三、DNA的體外重組 45
四、重組DNA的轉化 49
五、重組DNA的篩選與鋻定 49
六、目的基因的表達 50
參考文獻 52

第三章載體工程 55
第一節表件的優化 56
一、啟動子 56
二、增強子 66
三、多聚腺苷酸尾 67
四、內含子 67
五、內部核糖體進入位點和F2A 68
六、選擇標記 69
七、翻譯與分泌優化 69
第二節染色件 71
一、核基質附著區 72
二、遍在染色件 75
三、絕緣子 75
四、穩定件 76
第三節靶基因整合 77
一、位點特異性重組繫統 77
二、基於核酸酶和DNA修復途徑的位點特異性整合 79
第四節非靶向轉基因整合 80
一、轉座子 80
二、慢病毒載體 80
參考文獻 81

第四章轉染與篩選 87
第一節細胞轉染 87
一、細胞轉染的原理 87
二、細胞轉染方法 88
第二節細胞轉染後的篩選 93
一、瞬時轉染與穩定轉染 93
二、穩定細胞繫的篩選 94
三、CHO細胞加壓篩選 99
四、HEK293細胞表達繫統 102
參考文獻 106

第五章基因組編輯與細胞工程 108
第一節基因組編輯技術 109
一、概念 109
二、常用的基因組編輯技術 109
第二節CRISPR/Cas9技術在哺乳動物細胞中的應用 117
一、基因的破壞 119
二、位點特異性基因整合 120
三、基因激活或抑制 120
四、基因組水平目的基因敲除的篩選 121
五、基因編輯應用實驗設計 121
六、脫靶分析 124
第三節CHO細胞工程 125
一、目的基因 126
二、細胞工程常用技術 131
三、抗凋亡工程 134
四、代謝工程調控 135
五、細胞骨架與細胞周期工程 136
六、蛋白質翻譯後修飾工程 136
七、蛋白質合成工程 138
參考文獻 139

第六章動物細胞培養基及其優化 144
第一節細胞培養基 145
一、細胞培養基簡介 145
二、動物細胞培養基的分類 146
三、細胞培養基的相關政策與標準 151
四、細胞培養基的主要成分 162
五、細胞培養基的理化性質 170
六、細胞培養基的滅菌及儲存 171
七、細胞培養基的配制 173
第二節CHO細胞培養基 177
一、CHO細胞培養基概況 177
二、CHO細胞無血清培養基的成分組成及優化 179
第三節其他細胞繫培養基 182
一、HEK293細胞繫培養基 182
二、HeLa細胞繫培養基 183
參考文獻 184

第七章培養工藝與大規模培養 188
第一節動物細胞大規模培養參數 189
一、溫度 189
二、通氣 189
三、pH 190
四、滲透壓 190
五、攪拌 190
六、防止污染 190
第二節動物細胞大規模培養 191
一、動物細胞大規模培養反應器 191
二、動物細胞大規模培養操作方式 194
參考文獻 231

第八章哺乳動物細胞重組蛋白的分離及純化 234
第一節重組蛋白樣品的預處理 234
一、透析法 235
二、超濾法 235
三、冷凍干燥法 236
四、雙水相萃取法 236
第二節重組蛋白分離純化的原理及方法 237
一、蛋白質沉澱 237
二、親和色譜 242
三、高效液相色譜 247
四、分子篩色譜 254
五、離子交換色譜 256
六、其他純化技術 267
參考文獻 269

第九章重組蛋白分析與鋻定 271
第一節重組蛋白理化性質分析 272
一、重組蛋白的電荷異質性分析 272
二、重組蛋白分子量測定 275
三、重組蛋白的其他性質 277
第二節重組蛋白定量分析技術 278
一、標準定量法 279
二、比色分析法 280
三、紫外吸收法 282
四、ELISA測定 282
五、蛋白質印跡法 283
第三節空間結構分析 283
一、蛋白質的空間結構 284
二、X射線衍射晶體分析 285
三、核磁共振 287
四、生物質譜技術 290
參考文獻 292

第十章重組蛋白糖基化修飾與控制 295
第一節糖基化修飾類型及其作用 295
一、糖基化及其修飾類型 295
二、糖基化修飾的生物學作用 297
第二節重組蛋白糖基化工程及其應用 299
一、重組蛋白糖基化工程 299
二、重組蛋白糖基化修飾改造策略 299
三、重組蛋白糖基化工程的應用 301
第三節重組蛋白糖基化控制 302
一、基因組學水平 302
二、繫統生物學水平 305
三、質量控制與評價 306
參考文獻 308

第十一章重組抗體質量控制 311
第一節重組抗體生產細胞的質量控制 312
一、建構工程細胞和細胞庫 312
二、細胞質控 313
第二節重組抗體的質控標準物質 313
一、理化對照品的結構驗證 313
二、活性標準品的協作標定 314
第三節重組抗體生產產品的質量控制 315
一、產品質量一致性分析 315
二、生物學活性測定 317
三、蛋白質含量及純度測定 318
四、殘留雜質分析 319
五、安全性和其他檢測項目 319
第四節重組抗體生產實例——質量屬性評價 319
一、還原型毛細管凝膠電泳測定重組抗體的純度及雜質 319
二、分子排阻高效液相色譜測定重組抗體的純度及雜質 319
三、分子排阻色譜分離靜態光散射測定聚體的分子量 320
四、成像毛細管等電聚焦電泳檢測電荷異質性 320
五、圓二色譜分析抗體分子的結構 320
參考文獻 321

第十二章重組蛋白藥物的研究開發與管理 322
第一節重組蛋白藥物研究開發的一般過程 322
一、上遊研究 323
二、中試研究 324
三、臨床前研究 326
四、臨床研究 328
五、新藥臨床研究與生產的申報和審批 330
第二節重組蛋白藥物研究開發的相關法規 333
一、重組蛋白技術產品研究開發相關法規的主要內容 333
二、研發各個環節的質量管理規範 337
第三節重組蛋白技術產品的生物安全問題 339
一、重組蛋白技術產品及其產品生物安全問題的範圍 340
二、重組蛋白技術產品及其產品生物安全問題的預防和控制 341
三、生物安全性評價 342
參考文獻 344

附錄中英文詞彙表 347