了得網研究生_細胞生物學實驗技術教程（第四版）

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內容簡介

生命科學的進展日新月異，在培養創新型人纔的背景下，《細胞生物學實驗技術教程（第四版）》在第三版的基礎上，補充更新了實驗，並整合成8章，共56個實驗。**章詳細介紹了顯微鏡技術；第二章到第七章涵蓋了細胞器的形態與結構、細胞培養與DNA提取、細胞工程與轉基因技術、轉基因細胞的檢測、細胞電生理技術及細胞的生命活動與調節，各章均有實驗目的、實驗原理、結果與分析及思考題等；第八章立足於《細胞生物學實驗技術教程（第四版）》實驗的總結和對學生綜合創新能力的培養，提出了綜合實驗的設計原則和指導思想，並嘗試給出了4個綜合實驗的例子。

目錄
第四版前言
第三版前言
**章顯微成像技術 1
實驗1.1 普通復式顯微鏡 1
實驗1.2 相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡 11
實驗1.3 熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡 15
實驗1.4 電子顯微鏡 19
實驗1.5 電子顯微鏡樣品制備 24
第二章細胞及細胞器的形態與結構 34
實驗2.1 質膜的通透性和水孔蛋白通透效應的觀察 34
實驗2.2 植物細胞質膜的分離和純化技術 38
實驗2.3 離心技術與葉綠體和細胞核的分離 41
實驗2.4 核酸（DNA和RNA)的細胞核定位觀察 44
實驗2.5 細胞質骨架的光學顯微鏡觀察——考馬斯亮藍染色 46
實驗2.6 微絲骨架的特異性標記 48
實驗2.7 轉基因GFP-tubulin擬南芥的無菌培養及觀察 50
實驗2.8 果蠅中腸干細胞的形態與觀察 53
實驗2.9 線粒體的觀察 55
實驗2.10 線粒體的特異性熒光標記觀察 58
第三章細胞培養與DNA制備 61
實驗3.1 細菌質粒的提取和分析 61
實驗3.2 酵母細胞的培養、計數與觀察 67
實驗3.3 酵母DNA的提取 70
實驗3.4 線蟲DNA的提取 72
實驗3.5 植物懸浮細胞的培養 74
實驗3.6 植物基因組DNA的提取和分析 76
實驗3.7 果蠅S2細胞的培養與轉染 79
實驗3.8 果蠅基因組DNA的提取 83
第四章細胞工程與轉基因技術 86
實驗4.1 酵母細胞的乙酸鋰（LiAc)轉化 86
實驗4.2 HeLa細胞的傳代培養 93
實驗4.3 脂質體介導的外源基因轉染HeLa細胞 94
實驗4.4 植物原生質體的制備及基因的瞬時轉化 97
實驗4.5 細胞的融合 100
實驗4.6 農杆菌介導的葉盤法轉化煙草 103
實驗4.7 轉基因擬南芥的創建 109
實驗4.8 基因槍轉化技術 111
第五章轉基因細胞的檢測 117
實驗5.1 植物組織總RNA的提取 117
實驗5.2 RNA的定量和完整性分析 119
實驗5.3 轉基因細胞的RT-PCR檢測 121
實驗5.4 SDS-PAGE和蛋白質分子質量的測定 124
實驗 5.5 Western雜交 130
實驗5.6 凝膠阻滯分析 134
實驗5.7 免疫共沉澱技術 138
實驗5.8 熒光素酶報告基因的檢測 140
第六章細胞電生理技術 142
實驗6.1 非損傷微測技術簡介和H+微電極的操作 143
實驗6.2 蟑螂巨大神經和空氣振動感受器 148
實驗6.3 電壓鉗繫統和膜片鉗技術 152
實驗6.4 骨骼肌收縮綜合實驗 154
實驗6.5 神經干電生理實驗 159
實驗6.6 蟾蜍心搏描記實驗 164
實驗6.7 蛙類心髒的神經支配 168
第七章細胞的生命活動與調節 172
實驗7.1 酵母異源功能互補的功能鋻定 172
實驗7.2 質膜蛋白分選的膜泡運輸觀察 177
實驗7.3 植物細胞胞吞作用及內膜繫統的熒光顯微鏡觀察 181
實驗7.4 HeLa細胞有絲分裂的形態觀察 185
實驗7.5 植物細胞程序性死亡的誘導和梯狀DNA的觀察 187
實驗7.6 流式細胞儀觀察細胞周期 190
第八章細胞生物學綜合探究實驗 195
實驗8.1 細胞生物學綜合探究實驗設計舉例 195
實驗8.2 植物細胞探究性實驗設計方案舉例 197
實驗8.3 動物細胞探究性實驗設計方案舉例 197
實驗8.4 基因實驗設計方案舉例 198
主要參考文獻 202
附錄 206
彩圖

在線試讀

**章顯微成像技術
生物學，尤其是細胞生物學的許多重大發現與顯微技術的不斷創新、發展分不開。沒有顯微鏡的發明就不會有細胞的發現，更不會有細胞學說的建立。同樣，如果沒有電子顯微鏡的發明，人們就不會認識到細胞內部結構的復雜性。因此，顯微成像技術是生物學研究領域中一項常規的、不可缺少的技術手段之一。
從英國物理學家Hooke創制了**架具有科學研究價值的顯微鏡到現今光、機、電一體化的各種高檔顯微鏡已有350多年的歷史了。為適應不同需要，目前有各種類型的顯微鏡，如可直接進行解剖及觀察並具有立體感的體視顯微鏡；能觀察活細胞的相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡；對於雙折射物質進行結構研究的偏光顯微鏡；既能作形態觀察，又能作定位、定性分析的熒光顯微鏡；組織培養不可缺少的長工作距離的倒置顯微鏡；具高分辨率、可進行顯微斷層掃描的激光掃描共聚焦顯微鏡等。2014年諾貝爾化學獎授給了埃裡克貝齊格（Eric Betzig）、威廉莫納（William E.Moerner）和斯特凡黑爾（Stefan W.Hell），其主要的貢獻有：①超高分辨率光學顯微鏡STORM，使得在納米量級分辨率上對細胞和組織成像；②單分子熒光顯微鏡成像技術，這是顯微成像技術的巨大革命。
本章概述了幾種常用的光學顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡的原理、結構特點、應用及獲得*佳觀察及采集圖像效果的實踐要點。
實驗1.1普通復式顯微鏡
【實驗目的】
1.學習普通復式顯微鏡的使用。
2.熟練掌握顯微鏡的操作。
【實驗原理】
普通復式顯微鏡，即明場顯微鏡（bright field microscope，BF），可以說是*常用的一種顯微鏡，主要由3部分構成：①光學成像繫統，由物鏡和目鏡組成；②照明繫統，包括光源和聚光器；③機械裝置，包括鏡座、鏡臂及載物臺等，用於固定材料，觀察方便。高級研究用顯微鏡往往還配有顯微照相繫統。根據照明繫統和光學成像繫統在顯微鏡中的相對位置不同，顯微鏡可以分為正置顯微鏡、倒置顯微鏡及體視顯微鏡（圖1.1.1）。
正置顯微鏡是指光源和聚光鏡等照明繫統在載物臺的下方，而物鏡在載物臺上方的一種顯微鏡。由於其工作距離相對較短，因而適合於觀察放置在載玻片上的樣品。
圖1.1.1 Zeiss體視顯微鏡（A）、正置顯微鏡（B）和倒置顯微鏡（C）（Zeiss提供）
倒置顯微鏡和正置顯微鏡相比剛好相反，其物鏡、聚光鏡和光源的位置均顛倒過來，故稱為倒置顯微鏡。由於其具有較長的工作距離，因此除了載玻片之外還可用於生物學中的組織及原生質體培養、浮遊生物檢驗及流質沉澱物等的觀察和研究。有的標本要求其工作距離更長的超長工作距離的聚光鏡。為了達到較好的觀察和成像效果，一般要求使用皿底為0.17mm厚度玻璃的專用培養皿。
體視顯微鏡又稱“實體顯微鏡”或“解剖鏡”，是一種具有正像立體感的儀器，其雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行的，而是具有一定的夾角（體視角一般為12°~15°），因此，成像具有三維立體感。像是直立的，便於操作和解剖，這是由目鏡下方的稜鏡把像倒轉過來導致的。放大率**為200倍左右，但其工作距離長，有的體視顯微鏡在物鏡前加上0.5X附加鏡後，工作距離更長，便於操作。焦深大，易於觀察標本的斷層，具三維結構。視場直徑大，配上熒光裝置和自動數字照相繫統，可直接對大樣品進行熒光觀察、圖像采集及分析。體視顯微鏡標準物鏡的倍率為1X，為了改變它的倍率還附有幾種不同倍率的附加物鏡，如2X、0.75X、0.5X、0.3X等，以適應不同樣品鏡檢要求。
圖1.1.2 顯微鏡的成像原理圖
（一）普通復式顯微鏡的成像繫統
如圖1.1.2所示，顯微鏡主要由兩組放大繫統組成，一組為焦距很短的物鏡，另一組為焦距較長的目鏡。為了減少像差，顯微鏡的目鏡和物鏡各由多組透鏡構成，其中物鏡的構造尤為復雜，有的由16個透鏡組成。為了便於說明，圖中的物鏡和目鏡都簡化為單透鏡。物體AB位於物鏡的前焦點外但很靠近焦點的位置上，首先經過物鏡形成放大的倒立實像這個像位於目鏡的物方焦距內但很靠近焦點的位置上，作為目鏡的物體。目鏡將物鏡放大的實像又二次放大成虛像A"B"，位於觀察者的明視距離（距人眼250mm）處，供眼睛觀察。在視網膜上形成的是實像A"B"。
由於顯微鏡所要觀察的標本往往幾何尺寸很小，小至可與光波的波長相比較；根據光的電磁波理論，此時不能再近似地把光線看成是直線傳播，而要考慮衍射的影響。因此顯微鏡的成像過程是個比較復雜的衍射相干過程。由於衍射因素的影響，顯微鏡的分辨能力和放大率都受到一定限制。因此，常規的光學顯微鏡一般*小可觀察到0.2/μm左右的標本，有效放大率**為1500~1600倍。
（二）普通復式顯微鏡的照明繫統
英國人，愛德華尼爾遜（Edward Nelson）根據阿貝原理，發明了臨界照明法（critical illumination）或稱尼爾遜照明法（Nelson illumination）。原理是利用阿貝聚光器，將光源的發光體形狀的像聚焦於樣品平面上，使樣品能接受**亮度的照明，故稱臨界照明。這個方法多用於自然光，這種顯微鏡一般裝置較簡單，不具備視場光闌及孔徑光闌，隨著鎢絲燈的發明後，這種照明法就逐漸被改進，但因鎢絲燈的發光體形狀是條狀，聚焦於樣品平面上，有燈絲的部分明亮，其他地方則暗，使照明不均勻。
柯勒照明繫統是1893年，德國的一位年輕的動物學家柯格斯柯勒（August Kohler）在臨界照明法的基礎上改良的照明法，是在聚光器與光源之間，加上一個光源聚光器（lamp condenser）及視場光闌（field diaphragm）。利用光源聚光器將光源發光體形狀的像聚焦於孔徑光闌的平面上，而聚光器將視場光闌的像聚焦於樣品平面上（圖1.1.3）。這樣，無論光源燈絲形狀如何，視場光闌均受到*亮、*均勻的照明，並且樣品平面上照明區的大小和位置可以通過調節視場光闌的大小和位置來調控。柯勒照明的優點在於可使較小的鎢絲燈達到更高的照明亮度，光源的光束盡量利用，減少了內部散射光，而且控制了反差和深度，*重要的是樣品能得到平均照明，這在顯微照相中至關重要（圖1.1.3）。
圖1.1.3 柯勒照明成像光路圖（A）及柯勒照明發照明光路
a.真實像；b.目鏡；c.目鏡光闌；d.物鏡後焦面；e.物鏡；f.標本；g.聚光鏡；h.孔徑光闌；i.視場光闌；j.光源聚光鏡；k.燈絲
（三）顯微鏡的主要光學技術參數
顯微鏡的光學技術參數包括：數值孔徑、分辨率、總放大率、焦深、視場寬度、復蓋差、工作距離、圖像亮度、視場亮度。每個參數本身都有一定的合理極限，同時它們之間是相互聯繫又相互制約的，並不是每個參數越高越好。這些參數有的標在光學部件上，使用時應根據實驗的目的和實際需要，充分考慮顯微鏡的各項技術指標及參數的關繫，合理選擇及調節好顯微鏡各個部件，隻有這樣，纔能充分發揮顯微鏡應有的性能，獲得滿意效果。
1.數值孔徑
數值孔徑（numerical aperture）又稱“鏡口率”，簡寫NA或A，一般標刻在物鏡和聚光鏡的外殼或轉盤上（圖1.1.4）。數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數，尤其物鏡的數值孔徑大小是判斷顯微鏡性能高低的重要標志。物鏡的數值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率（〃）和孔徑角（2〃）半數的正弦之乘積，用公式表7K為：NA=7zsim/。
孔徑角又稱“鏡口角”（圖1.1.4），是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大，進入物鏡的光通量就越大。它與物鏡前透鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。
圖1.1.4 物鏡的數值孔徑與孔徑角
A.盛仙永拍攝；B.印莉萍，2005
干燥繫物鏡，因物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質為空氣，空氣的折射率為1，孔徑角小於180°（否則物鏡的工作距離等於零，無法工作），因此，干燥繫統的物鏡的NA值始終小於1。
基於這一原理，若想增大NA值，由於孔徑角是無法增大的，**的辦法是用較大折射率的介質，如水的折射率為1.333，香柏油的折射率為1.515。因介質的折射率值大於1，NA值就能大於1，故水浸繫物鏡的NA值**約為1.2，浸油繫物鏡NA值**可達1.45。
聚光鏡的類型不同，其NA值的大小也不同，一般說來為0.05~1.4，它可通過調節孔徑光闌的大小來改變NA值的大小，從而達到與物鏡NA值相匹配的使用效果。有的聚光鏡還可以把上透鏡推出光路，即搖出搖入式聚光器，當低倍鏡檢時將上透鏡搖出光路，NA值則下降。當換成高倍物鏡時，將上透鏡推入光路。
為了充分發揮物鏡數值孔徑的**作用，注意調節聚光鏡的孔徑光闌。一般觀察時，使其數值孔徑NA值等於或大於物鏡的NA值，在顯微照相及數碼采集時，則應小於物鏡的NA值。
數值孔徑還與其他技術參數有著密切的關繫，它幾乎決定和影響著其他各項技術參數，它與分辨率成正比，與放大率（有效放大率）成正比，與焦深成反比，NA值的平方與圖像亮度成正比，NA值越大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。
2.分辨率
顯微鏡的分辨率（resolution）是指兩點能清楚分開的極限距離。在顯微鏡的設計中，規定當一個圓斑像的圓心剛好落在另一個圓斑像的圓周上，則認為兩物點的像剛剛能夠被分開，如圖1.1.5所示，就是分辨的*小距離。
分辨率的大小決定了顯微鏡分辨試樣上細節的程度，具有高分辨率的高質量的物鏡是產生清晰準確圖像的關鍵。因顯微鏡的物鏡是使物體放大成一倒立實像，目鏡的作用是使這個實像再次放大；這就是說目鏡隻能放大物鏡已分辨的細節，物鏡未能分辨的細節絕不會通過目鏡放大而變得可分辨。因此，顯微鏡的分辨率主要取決於物鏡的分辨率。
物鏡分辨率的表達式如下：
D=0.61λ/NA
式中，A為入射光的波長，NA為物鏡的數值孔徑。由表達式可知，對於一定波長的人射光，物鏡的分辨率完全取決於物鏡的數值孔徑，即數值孔徑越大，分辨率越高。
在顯微鏡下看到的圖像，不論是什麼結構，都可以看作由億萬個物體點組成，各點的顏色、位置、亮度各有不同。由於光波的衍射特性、光學繫統殘留的像差、玻璃的質量及雜散光等多種因素的影響，每個物體點經物鏡成像後，不可能是一個清晰的點像，而是呈現一定大小衍射斑的彌散圓像。這種衍射效應嚴重阻礙分辨率的提高。
3.放大率
放大率（magnification）就是放大倍數，是指被檢物體經物鏡放大再經目鏡放大後，人眼所看到的*終圖像的大小與物體原大小的比值，是物鏡和目鏡放大倍數的乘積，即總放大率=物鏡放大率×目鏡放大率。物鏡和目鏡的放大倍數均標刻在其外殼上。
顯微鏡的放大倍數是指長度的放大，而不是指面積的放大。例如，1μm的物體，在顯微鏡下放大100倍，則長度為100μm，若以面積計算，則為10000μm2。
顯微鏡的放大率存在一定限度。其*適當的總放大率，原則上是在標準筒長下，所使用的物鏡NA值的500~1000倍，這個範圍內的總放大率稱為“有效放大率”或“合理放大率”；超越這個範圍的放大率則稱為“無效放大”或“空虛放大”。觀察時應在有效放大率的範圍內來選擇物鏡和目鏡的配合。例如，使用NA為1.4（100X）的物鏡時，應在700~1400倍放大率的範圍內選用目鏡的放大倍數，即7X~14X的目鏡比較合適。若用5X的目鏡則達不到人眼所能分辨的大小；用15X或20X的目鏡則為無效放大。因此在觀察時，一般使用10X的目鏡為好。高級的研究用顯微鏡常隻配一對10X的目鏡。10X目鏡為“標準目鏡”。作高倍鏡檢時，應首先考慮更換物鏡，而不要盲目更換過高倍率的目鏡。
4.焦深
焦深

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