了得網自然科學_現代基因治療分子生物學（第二版）

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《現代基因治療分子生物學》內容翔實、資料新穎，適合臨床醫生、醫學和分子生物學科研工
人員等參考使用。

內容簡介

基因治療是將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學技術，自20世紀90年代以來一直是腫瘤治療等方面的研究熱點，但直到目前仍有許多問題需要解決。本書是成軍教授《基因治療》（1993年）的再版，旨在對近十年來國內外基因治療的新認識、新觀點、新技術和新成就進行繫統、集中展示，並對基因治療研究中的難點和熱點問題進行歸納、總結。本書適合分子生物學、腫瘤學、內科學臨床醫生、科研人員和研究生參考使用。

作者簡介

章基因治療概論
節基因治療的基本概念
第二節基因治療的發展
第三節基因治療的臨床應用
第二章基因克隆
節基因克隆的基本原理
第二節基因克隆的工具酶
第三節基因克隆中的載體
第四節基因克隆的程序
第五節真核基因組DNA的克隆
第三章基因的人工合成
節基因人工合成的發展和策略
第二節核酸小片段的人工合成
第三節核酸大片段的人工合成章基因治療概論
節基因治療的基本概念
第二節基因治療的發展
第三節基因治療的臨床應用
第二章基因克隆
節基因克隆的基本原理
第二節基因克隆的工具酶
第三節基因克隆中的載體
第四節基因克隆的程序
第五節真核基因組DNA的克隆
第三章基因的人工合成
節基因人工合成的發展和策略
第二節核酸小片段的人工合成
第三節核酸大片段的人工合成
第四節基因人工合成的應用
第四章基因的PCR擴增
節 PCR技術的發展
第二節 PCR技術的原理
第三節 PCR擴增目的基因
第四節 PCR技術的應用
第五章基因轉移的靶細胞
節靶細胞的選擇條件
第二節腫瘤浸潤的淋巴細胞
第三節血液細胞
第四節實質器官細胞
第五節其他靶細胞
第六章干細胞與基因治療
節胚胎干細胞
第二節成年干細胞
第三節誘生性多能干細胞
第四節腫瘤干細胞
第五節干細胞應用於治療領域面臨的問題
第六節干細胞治療的臨床試驗
第七章基因的轉移方法
節基因轉移的物理法
第二節基因轉移的化學法
第三節基因轉移的融合法
第四節顆粒轟擊技術
第五節病毒載體基因轉移技術
第八章反轉錄病毒載體
節反轉錄病毒基因結構及其復制特點
第二節反轉錄病毒載體的構建
第三節包裝細胞的構建
第四節反轉錄病毒載體的應用
第九章腺病毒載體
節腺病毒的生物學特性和基因結構
第二節腺病毒基因的改造
第三節腺病毒載體與基因治療
第十章腺相關病毒載體
第十一章單純皰疹病毒載體
節單純皰疹病毒的基因結構
第二節單純皰疹病毒載體的構建
第三節單純皰疹病毒載體在基因治療中的應用
第十二章人類免疫缺陷病毒載體
節人類免疫缺陷病毒的基因結構
第二節人類免疫缺陷病毒基因的改造
第三節人類免疫缺陷病毒載體與基因治療
第十三章慢病毒載體
節慢病毒載體繫統的結構及其優化
第二節慢病毒載體與基因治療
第十四章杆狀病毒載體
節杆狀病毒感染昆蟲細胞
第二節杆狀病毒轉導哺乳動物細胞
第三節杆狀病毒進入哺乳動物細胞的機制
第四節病毒表達
第五節病毒載體傳代和病毒蛋白制備
第六節基因功能和病毒感染的研究
第七節穩定細胞繫的傳代
第八節體內基因治療
第九節體外基因治療
第十節作為疫苗載體的免疫學反應和潛能
第十五章空泡病毒載體
節 SV40的分子生物學特性
第二節 SV40的基因改造
第十六章基因治療的基因調控
節基因調控的結構基礎
第二節基因靶技術
第三節反轉錄病毒載體基因轉移的調控
第四節干擾素基因及其調控
第十七章 RNA干擾與基因治療
節 RNA干擾技術的原理
第二節 RNA干擾技術的應用
第三節 RNA干擾技術與基因治療
第十八章 miRNA與基因治療
節 miRNA干擾技術的原理
第二節 miRNA與疾病的關繫
第三節 miRNA在基因治療方面的初步應用
第十九章 DNA疫苗
節 DNA疫苗的概況
第二節腫瘤DNA疫苗
第三節乙型肝炎病毒DNA疫苗
第四節丙型肝炎病毒DNA疫苗
第五節艾滋病DNA疫苗
第六節狂犬病毒DNA疫苗
第七節瘧原蟲DNA疫苗
第八節結核分枝杆菌DNA疫苗
第二十章基因治療的管理
節基因治療的安全性
第二節基因治療的社會倫理問題
第三節國外基因治療審批機構
第四節基因治療的法律問題
第五節關於我國基因治療研究管理的建議
第二十一章遺傳病的基因治療
節遺傳病的分類
第二節遺傳病基因治療總體設想
第三節苯丙酮尿癥的基因治療
第四節白細胞黏附不全癥的基因治療
第五節遺傳性酶病的基因治療
第六節 β一地中海貧血的基因治療
第七節 Duchenne肌營養不良的基因治療
第八節血友病的基因治療
第二十二章腫瘤的基因治療策略
節抗腫瘤基因治療總體構想
第二節抗癌基因轉移
第三節細胞因子基因轉移與抗腫瘤基因治療
第四節 MHC基因轉移
第五節病毒基因轉移
第六節病毒主導性酶藥物預施療法
第七節反義技術抗腫瘤
第八節端粒酶基因轉移
第九節基因治療抑制腫瘤轉移
第十節基因治療逆轉腫瘤耐藥
第二十三章腫瘤的基因治療
節食管癌的基因治療
第二節胃癌的基因治療
第三節胰腺癌的基因治療
第四節肝癌的基因治療
第五節腸癌的基因治療
第六節肺癌的基因治療
第七節神經膠質瘤的基因治療
第八節髓母細胞瘤的基因治療
第九節甲狀腺癌的基因治療
第十節眼部腫瘤的基因治療
第十一節喉癌的基因治療
第十二節鼻咽癌的基因治療
第十三節腎癌的基因治療
第十四節膀胱癌的基因治療
第十五節前列腺癌的基因治療
第十六節乳腺癌的基因治療
第十七節卵巢癌的基因治療
第十八節宮頸癌的基因治療
第十九節淋巴瘤的基因治療
第二十節白血病的基因治療
第二十一節骨腫瘤的基因治療
第二十二節黑色素瘤的基因治療
第二十四章呼吸繫統疾病的基因治療
節呼吸繫統疾病基因治療的策略和途徑
第二節囊性纖維化的基因治療
第三節 αl—抗胰蛋白酶缺乏癥的基因治療
第四節其他呼吸繫統疾病的基因治療
第二十五章心血管繫統疾病的基因治療
節心血管繫統疾病的基因治療概述
第二節家族性高膽固醇血癥的基因治療
第三節血栓形成和再狹窄的基因治療
第四節心血管繫統基因的轉移與全身性疾病
第五節心力衰竭的基因治療
第六節缺血性心肌病的基因治療
第二十六章消化繫統疾病的基因治療
節消化繫統疾病基因治療的策略和條件
第二節某些肝髒疾病的基因治療
第三節胃腸道疾病的基因治療
第二十七章血液繫統疾病的基因治療
節血液繫統疾病基因治療的策略
第二節血液繫統疾病基因治療的條件
第三節地中海貧血的基因治療
第四節血友病的基因治療
第五節鐮狀細胞貧血的基因治療
第二十八章中樞神經繫統疾病的基因治療
節神經繫統疾病基因治療的策略和條件
第二節 Lesch Nyhan綜合征的基因治療
第三節其他中樞神經繫統疾病的基因治療
第四節腦血管疾病的基因治療
第五節癲痫的基因治療
第六節 Canavan病的基因治療
第二十九章內分泌疾病的基因治療
節內分泌疾病基因治療的策略和條件
第二節胰島素的基因結構
第三節糖尿病的基因治療
第四節 Prader—Willi綜合征的遺傳學基礎與治療
第三十章抗病毒基因治療
節抗病毒基因治療的策略
第二節基於蛋白質的基因治療
第三節基於核酸的基因治療
第四節基因疫苗
第三十一章單鏈可變區抗體與基因治療
節單鏈可變區抗體的結構、特點與表達
第二節單鏈可變區抗體的篩選
第三節單鏈可變區抗體的應用
第四節單鏈可變區抗體與細胞內免疫
第三十二章獲得性免疫缺陷綜合征的基因治療
節人類免疫缺陷病毒感染及臨床結局
第二節人類免疫缺陷病毒感染的治療
第三節獲得性免疫缺陷綜合征的基因治療
第三十三章慢性乙型肝炎的基因治療
節慢性乙型肝炎基因治療概論
第二節慢性乙型肝炎基因治療的現狀與展望
第三節慢性乙型肝炎基因治療的研究進展
第三十四章慢性丙型肝炎的基因治療
節丙型肝炎病毒感染及臨床結局
第二節丙型肝炎病毒感染治療的發展
第三節丙型肝炎病毒感染的基因治療
第三十五章肝纖維化的基因治療
節肝纖維化的分子機制
第二節肝星狀細胞的基因治療
第三節抗肝纖維化的基因治療
第三十六章免疫缺陷病的基因治療
節免疫缺陷病的分類
第二節 ADA缺乏癥的基因治療
第三節免疫調節因子的基因轉移與表達
第三十七章基因治療人體試驗
節基礎階段
第二節外源基因導入人體試驗
第三節基因治療臨床試驗
第四節人體基因治療的展望
第五節人體基因治療的倫理問題
索引

前言

媒體評論

在線試讀

章基因治療概論基因治療是指將外源功能基因導入靶細胞，以糾正或補償基因缺陷和異常所致的疾病，從而達到治療目的的治療方法。基因治療的概念於1972年提出，1989年R0senberg等利用反轉錄病毒載體實施例人類基因治療試驗。前期基因治療研究的失敗一度使人們認為其前景黯淡。至2006年前後，萊伯先天性黑朦癥(Leber'sc0ngenitalamaur0sis)、腺昔脫氨酶缺乏性重度聯合免疫缺陷癥(aden0sinedeaminase-deficientseverec0mbinedimmun0defi-ciency)及X重度聯合免疫缺陷癥(X-linkedseverec0mbinedimmun0deficiency)等多種疾病的基因治療相繼成功實施，受此鼓舞，研究人員再度燃起對基因治療研究的熱情。2012年，alip0genetiparv0vec(商品名為Glybera)成為首個在歐美被批準用於嚴格限制脂肪飲食卻仍然發生嚴重或反復膜腺炎發作的脂蛋白脂酶缺乏癥患者的基因治療藥物。至2014年，約有2000項基因治療方法正在進行臨床研究或被批準用於臨床治療。一、基因治店的分類基因治療可分為體細胞基因治療與生殖細胞基因治療，目前隻有體細胞基因治療被批準用於人類疾病的治療。體細胞基因治療是將治療基因轉入患者的體細胞(非生殖細胞)內，因此治療效果僅限於患者個體，而不會遺傳給患者的下一代。目前僅在美國進行的體細胞基因治療研究就超過600項。這些研究大多集中於嚴重的遺傳缺陷，如免疫缺陷、血友病、地中海貧血與囊性纖維病等。這些疾病之所以成為基因治療的目標，是由於這些疾病都是體內單基因缺陷所造成的。但目前隻有少數臨床研究獲得臨床批準或進入臨床研究的後期階段。生殖細胞基因治療是指用功能基因來修飾生殖細胞(包括精子與卵子)，這些修飾後的生殖細胞在完成受精後可進一步分化，以致新生動物的全部體細胞均攜帶該功能基因，且能夠遺傳給下一代。但由於潛在的風險與倫理問題，生殖細胞基因治療面臨巨大的爭議，目前未被批準用於人類疾病的治療。二、基因治店的主要策略基因治療包括致病基因的原位置換(基因置換)、基因的異位替代(基因替代)、直接抑制有害基因的表達(基因失活)、增強機體免疫能力的基因治療(免疫調節)及"自殺基因"等多種治療策略。基因置換是用正常的基因置換染色體上的致病基因。但目前基因定向同源重組的技術還不能達到理想效果。基因替代是在體外將正常基因轉移到患者的宿主細胞，隻要求治療基因能夠替代致病基因在體內表達出功能正常的蛋白質，也稱為基因增補，是目前常用的基因治療策略。基因失活用於已知某一疾病是由於某一基因的過度表達引起，可向患者體內導人某一抑制該基因的基因(如向腫瘤細胞中導人腫瘤抑制基因p53等)或有抑制該基因作用的核酸，或借助生物技術(反義RNA、siRNA、核酶、膚核酸等)抑制或封閉該疾病基因的mRNA功能。免疫調節基因治療是指將抗體或細胞因子(如腫瘤壞死因子α、干擾素γ等)的基因導人腫瘤細胞以激活體內免疫細胞的活力。其他基因治療策略如"自殺基因"是指將病毒、細菌等原核生物中具有特殊功能的酶類基因轉人哺乳動物細胞，其產生的酶能將無毒或毒性極低的藥物前體轉化成細胞毒性代謝產物，導致腫瘤細胞自殺，因此又稱為病毒導向酶解藥物前體療法。三、基因臺後的步驟一個完整的基因治療包括選擇治療基因、選擇基因治療的靶細胞、將治療性基因導人細胞、外源基因的表達與檢測，以及終將外源基因導人體內5個步驟。理論上，視需治療的疾病不同，細胞內的基因在理論上均可用於基因治療，但可有針對性地進行選擇，如生長因子、多膚類激素、細胞因子、可溶性受體及細胞內酶、轉錄因子等的基因均可作為治療性基因。基因治療的靶細胞要求來源容易、易在體外培養和擴增、易於被基因轉染並進行高效表達、易於體內移植或回輸、用於人體後所攜帶的目的基因能穩定地表達並具有比較長的生存壽命。一般選擇病變組織細胞或正常的免疫功能細胞，如淋巴細胞類、腫瘤細胞、造血干細胞、肌細胞或皮膚成纖維細胞等。造血干細胞是骨髓中具有高度自我更新能力、能永久重建造血的細胞，同時它能進一步分化為其他血細胞，並能保持基因組DNA的穩定，在體外經過擴增後已成為基因治療有前途的靶細胞之一。但其在骨髓中含量低，難以獲得足夠的量。皮膚成纖維細胞是一種容易獲得、可在體外培養並進行遺傳修飾的細胞。經修飾的細胞又容易移植回體內，必要時還可將已植人的細胞重新移走，終止其介導的基因治療。例如，目前有多項研究將細胞因子基因轉移到小鼠皮膚成纖維細胞，然後再移植回小鼠。這些細胞在體內持續分泌細胞因子，使小鼠對腫瘤的免疫功能明顯增強。肌細胞有著特殊的T管繫統，可與細胞外直接相通，利於注射的質粒DNA內吞人細胞。而且肌細胞內的溶酶體和DNA酶含量也很低，質粒DNA以環狀形式在胞質中存在但不整合人基因組DNA，可在肌細胞內較長時間保留。四、基因臺後的載體基因治療所用的載體主要分為非病毒載體和病毒載體。非病毒載體主要有裸DNA、脂質體、陽離子聚合物等，其特點是毒性小、安全性高、外源基因長度不受限制。病毒載體是基因治療中應用較多的載體，主要有反轉錄病毒載體(包括反轉錄病毒載體和慢病毒載體等)、腺病毒載體、腺相關病毒載體等，病毒載體的主要優點是具有有效進人細胞並且表達外源基因的能力。隨著科學技術的發展，許多載體經過改造後已經應用到臨床基因治療中且基因長度不受限制。(一)病毒載體1.反轉錄病毒反轉錄病毒(retr0virus，RV)是單鏈RNA病毒，可高效地感染許多類型的宿主細胞，穩定地整合到宿主細胞基因組中並持續表達。其中，反轉錄病毒載體是早被改造且廣泛地被應用到基因治療當中。在阿爾茨海默病、多形性成膠質細胞瘤、艾滋病、慢性肉芽腫等疾病的臨床試驗中，反轉錄病毒載體也得到了廣泛應用。雖然反轉錄病毒載體在基因治療中展現出巨大的潛力，但也存在著一些不足，如不能感染非分裂細胞;轉錄終止能力相對較弱，從而有可能造成轉錄通讀;可能產生有復制能力的病毒;可能造成插入性突變;包裝外源基因的能力有限(一般在7kb以下)等。受到臨床基因治療不良事件的影響，目前反轉錄病毒載體在基因治療中的使用比例為19%(2004年為28%)。為改善反轉錄病毒基因治療中可能出現的風險問題，科學家不斷研究並提出了定向感染、局部注入、定點插入、使用細胞特異性啟動子與增強子、自滅活設計、共表達自殺基因等措施，來提高反轉錄病毒載體的有效性和安全性。2.慢病毒載體慢病毒(1entivirus，LV)屬於反轉錄病毒科慢病毒屬，包括I型人免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒和牛免疫缺陷病毒等。慢病毒載體與以往的反轉錄病毒載體不同，它能同時感染分裂和非分裂細胞，而且較腺病毒載體的免疫反應小，其轉移基因片段容量比較大，並能長期穩定地表達。由於初研發的慢病毒載體來源於HIV-1，其生物安全性也備受關注。慢病毒載體的改造包括刪除野生型HIV-1的輔助蛋白、功能性刪減長末端重復序列、使用三質粒或多質粒繫統(包裝質粒、包膜質粒及病毒轉移載體等)。這些調整使得慢病毒載體不易發生同源重組，不易產生具有復制能力的重組活病毒。與反轉錄病毒載體相比，慢病毒載體有許多優點:其感染不依賴於細胞分裂，從而縮短細胞培養時間，保證轉導過程中造血干細胞的活力;通過自滅活設計可減少整合載體對附近基因表達的干擾;使用WAS內源鄰近啟動子來表達全長WAScDNA。近年來，使用慢病毒載體進行治療所取得的成功，展現出慢病毒載體的優越性，並繼續為基因治療的發展鋪平道路。3.腺病毒載體腺病毒(aden0virus，AdV)是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，目前應用的腺病毒載體主要是在2型(Ad2)或5型(Ad5)基礎上所構建。腺病毒載體是目前臨床基因治療中使用多的載體，占所有使用的基因治療載體的24%。腺病毒載體宿主細胞範圍廣泛，既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞，容易制備高滴度病毒顆粒，在宿主細胞內不發生整合，因而無插入突變的風險，載體容量較大。然而，其缺乏特異靶向性，在一些缺乏其相應受體的細胞中感染效率低。因其不能整合到入宿主染色體，所以目的基因的表達時間也較短，可能需要重復給予載體制劑進行治療。在體內應用時產生的免疫反應也限制了其應用。臨床基因治療中發生的個嚴重不良事件是18歲的鳥氨酸轉氨甲眈酶缺陷患者在接受重組腺病毒載體基因治療過程中死亡，原因是在肝動脈注射給藥數小時後出現了嚴重的炎癥反應。這使研究者對腺病毒載體的應用更為謹慎。科學家對腺病毒載體的改造經歷了多個階段，逐漸產生了代腺病毒載體，即刪除E1(病毒復制必須區)和E3(病毒復制非必須區)區以便插入目的基因，產生復制缺陷型重組腺病毒載體;第二代腺病毒載體，即在E1、E3區缺失的基礎上進一步去除E4(有效調節晚期基因轉錄)區;第三代腺病毒載體缺失了除末端重復序列和包裝信號序列以外的所有病毒基因，有效地降低了機體的免疫反應，使治療基因的表達持續時間延長，同時也提高了載體包裝長插入子的能力。雖然腺病毒載體在臨床基因治療過程中取得一些成功，但仍面臨著免疫原性和靶向性等問題，尚有較大的改造空間。科學家針對這些問題提出的觀點包括:對患者進行暫時的免疫抑制，屏蔽主要的抗原，使用不同血清型病毒外殼，對病毒外殼進行遺傳學修飾，使用特異性啟動子等，對腺病毒載體進行改造，期望腺病毒載體能更廣泛地應用於人類基因治療中。4.腺相關病毒載體腺相關病毒(aden0-ass0ciatedvirus，AA包膜單鏈DNA病毒，屬於細小病毒(parv0-virus)家族，臨床基因治療中使用該載體所占的比例為5%。目前已發現12種血清型，從AAV1到AAV12具有不同的組織取向性。腺相關病毒載體在基因治療中有以下優勢:非致病性和小限度的免疫原性皿J，不與任何人類疾病相關，載體安全性較好;具有廣泛的組織細胞取向，有的甚至可以隻在腫瘤細胞中復制和存活;可感染分裂細胞和非分裂細胞;重組腺相關病毒(rAAV)載體可通過異源提供所有的病毒蛋白，僅保留兩端很短的末端倒轉重復序列;被rAAV重組假病毒顆粒轉染後，目的基因可較穩定地表達。重組腺相關病毒載體同時具有以下缺點:包裝容量較小，約為4.7kb(盡管已有重組技術來增加其插入子的長度)，超過包裝限制後病毒滴度會顯著地下降。臨床研究表明rAAV基因藥物本身安全，很少引起嚴重的毒副作用。隨著臨床前及臨床研究的不斷深入，對於rAAV基因藥物潛在的免疫原性、細胞靶向性轉導，以及如何提高轉導效率、持久表達外源基因及目的基因包裝容量等問題都有待進一步改善。5.其他病毒載體在臨床基因治療中其他使用較多的病毒載體還有牛癥病毒載體(8%)、癥病毒載體(5%)、單純性殖摩病毒載體(3%)等。由於其各自不同的特點，近年來這些載體在臨床基因治療中的應用有所增加，特別是在癌癥及神經繫統疾病當中。在一些疾病的臨床治療中使用2種或3種病毒載體或者病毒載體與非病毒載體聯合使用，以期降低免疫原性，獲得更好的治療效果。(二)非病毒載體在臨床基因治療中，對於病毒載體安全性的考量以及其較小的載體容量，促進了非病毒載體繫統的發展。非病毒載體具有成本低、制備簡單、便於大規模生產、安全性高、外源基因長度不受限制等優點。簡單的非病毒基因轉移繫統是裸DNA，可直接注入特定的組織，特別是肌肉，並進行較高水平的表達。在臨床基因治療中裸DNA應用較為廣泛，所占的比例達到18%。其次在臨床基因治療中使用較多的是脂質體轉染，包括陽離子脂質體/DNA復合物，使用頻率達6%。目前，正在研究的非病毒載體還有聚合物、復合載體及納米粒子載體等。就非病毒載體研究來說，體外試驗以及動物試驗的成功與人體臨床治療還有很大差距。雖然非病毒載體有安全性高、毒性小、容量大等優點，但其轉染效率還是不理想、外源基因轉導到宿主細胞後表達時間短等問題，使得非病毒載體進入臨床治療還需要進行更深入的研究與改進。第二節基因治療的發展基因治療的發展大體上可分成基因治療的形成階段、基因治療的

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